Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Массовое производство энтомопатогенных бактерий

30.11.2018

Производство на продажу комбинированных препаратов В. popilliae и В. lentimorhus Dutky и отдельных препаратов В. thuringiensis — пример успешного развития методики получения бактерий in vivo и in vitro. Для производства спор бактерий молочной болезни В. popilliae и В. lentimorbus требуется живой естественный хозяин. В этой роли выступают только личинки японского жука Р. japonica Newman, хотя болезнетворные организмы способны заражать и других личинок жуков-скарабеид. Использование только одного хозяина позволяет бактериям сохранять вирулентность к виду-мишени. Подробности методики производства спор молочной болезни обсуждаются у Даткн и Штейнкрауса. Условия для роста бактерий изучали Штейнкраус и Проввидеити.

Личинок японского жука заражают поодиночке через шприц точно отмеренной дозой спор молочной болезни в водной суспензии. Посевной материал спор от ранее зараженных личинок обычно сохраняется в виде высушенного мазка гемолимфы на предметном стекле. Зараженных личинок помещают по одной в камеры, наполненные почвой и семенами травы. Там, в условиях достаточной влажности, их содержат при температуре 30°С в течение 10—18 дней. За это время завершается размножение и споруляция бацилл. После инкубации личинок промывают в воде и помещают их в холодильник. Для извлечения спор зараженных личинок гомогенизируют и полученную массу размешивают в дистиллированной воде. К образовавшейся суспензии, проверив содержание в ней спор в камере для подсчета бактерий, добавляют сухой инертный наполнитель. 1 г стандартного продукта должен содержать 100 млн. жизнеспособных спор. В США полученный таким образом порошок фасуется и продастся под названиями «Japidemic» и «Doom» самой старой в мире промышленной лабораторией патологии насекомых, Fairfax Biological Laboratory в Клинтон-Корнерс, штат Нью-Йорк. Попытки использовать для выращивания бактерий искусственные среды пока были безуспешными — споруляция в них идет слабо. Процесс споруляции in vivo детально изучался с целью помочь его воспроизведению in vitro. Штейнкраус и Таширо смогли получить некоторое количество спор на искусственных средах, перенося вегетативные клетки на обедненную среду или повышая температуру ростовой среды до 45°С. Однако, когда проверили вирулентность этих спор, введя их per os личинкам жука, оказалось что она на 80% утрачена.

В отличие от В. popilliae и В. lentimorbus В. thuringiensis хорошо растет in vitro. Ее различные имеющиеся в продаже препараты (например, Biotrol, Thuricide, Dipel) зарегистрированы Министерством сельского хозяйства США; на них не распространяются правила, требующие от средств защиты растений быстрого распада во внешней среде. Благодаря способности бактерий расти на искусственных средах нет необходимости в больших затратах на разведение насекомых-хозяев на искусственной или естественной пище или же на сбор их в поле. Кроме того, отпадают трудности, связанные с изменчивостью хозяев, из-за которой выход патогена может падать. Бриггс перечисляет шесть общих требований к промышленному массовому разведению В. t.

Первое требование — наличие подходящей искусственной среды, содержащей все питательные вещества, факторы роста и микроэлементы, нужные для поддержания максимального размножения патогена при минимальных расходах. Сейчас при массовом разведении применяются два процесса: ферментация на полутвердой среде на основе отрубей и глубинная ферментация. В результате первого процесса получают либо смачивающийся порошок, либо дуст, содержащий споры, кристаллы и экзотоксины. С помощью глубинной ферментации получают суспензии, содержащие те же три действующих компонента. Второе требование — наличие инокулята для засева культуральной среды. При глубинном методе для заражения среды в больших ферментерах емкостью до 200 000 л применяют чистые культуры клеток В. t. в активной логарифмической фазе роста. Объем инокулята должен составлять 1—2% общего объема среды в ферментере. Третье требование — инкубация и рост В. t. должны проходить в идеально стерильных условиях, чтобы уменьшить конкуренцию со стороны загрязняющих видов микроорганизмов. Для обеспечения успешного производства необходим строгий контроль за состоянием искусственной среды. В. t. — спорообразующий аэроб, поэтому при использовании обоих методов требуется дополнительная аэрация. В случае глубинной ферментации в жидкой среде необходимо еще и механическое перемешивание. Оптимальная температура для роста 30°С, pH должен быть нейтральным. Полное развитие бактерий достигается через 28—48 ч после инокуляции.

Четвертое требование — выделение токсинов и спор. В жидкой среде их выделяют с помощью центрифугирования. После центрифугирования концентрированный осадок разбавляют стабилизирующими веществами и полученный жидкий препарат расфасовывают. Растворимые экзотоксины можно отдельно осадить из культуральной жидкости и извлечь вместе с отцентрифугированными спорами и кристаллами. При использовании полутвердой среды влажная масса отрубей, содержащая споры, кристаллы и экзотоксины, подсушивается на воздухе, затем размалывается или измельчается протиранием через сита (80 меш) и, наконец, расфасовывается.

Следующее, пятое требование — необходимость стандартизации конечного продукта путем оценки его эффективности. Бонфуа и сотр. и Бюржержон уже давно настаивали на необходимости стандартизации В. t. методами биопробы, но только в 1966 г. был принят первый международный эталон-стандарт для биопроб — штамм В. t. Е-61. Стандартной культуре Е-61, хранящейся в Институте Пастера в Париже, была приписана условная эффективность в 1000 международных единиц (ME) на 1 мг. До 1966 г. для стандартизации поступающих в продажу препаратов применялся подсчет спор, но это неточный метод, так как он дает лишь непрямую оценку эффективности продукта, которая часто больше зависит не от числа спор, а от присутствия токсинов. Через пять лет после принятия стандарта Е-61 в США был установлен вторичный стандарт, эффективность которого была определена по отношению к первичному стандарту Е-61. Американский стандарт основан на В. thuringiensis var kursiaki, его обозначают HD-1-S-1971. Штамму HD-1-S-1971 была приписана эффективность 18 000 МЕ/мг, а в качестве стандартного хозяина для биопроб была избрана совка ни Trichoplusia ni (Hubner). Метод биопробы состоит в сравнении испытуемого и стандартного (контрольного) препаратов В. t., которые подмешивают в искусственные рационы и скармливают тест-насекомым. Количество испытуемого препарата, вызывающее у тест-насекомых за определенное время 50%-ную смертность, делят на количество стандартного препарата, дающего за то же время такую же смертность, и получают так называемое «соотношение силы». Если это соотношение для испытуемого и стандартного препарата равно 1:1, то их эффективности одинаковы.

Последнее требование к массовому производству касается разнообразия имеющихся в продаже препаратов. В. t. фасуется в виде смачивающихся порошков, дустов, гранул и жидких концентратов. В мире производится не менее 8 поступающих в продажу препаратов: 3 в США, 2 в России, по одному во Франции и Чехии. Эти препараты совместимы CO многими химическими инсектицидами, приманками, жидкими добавками, поверхностно-активными веществами, фунгицидами, паразитоидами, хищниками, программами стерилизации, хемостерилянтами, феромонами, а также с другими микробными патогенами. Комбинирование В. t. с любым из указанных веществ, организмов или мероприятий может дать полезный синергический эффект. В. t. имеет преимущества по сравнению с синтетическими химическими инсектицидами, так как она действует избирательно, но она не способна защитить сельскохозяйственные культуры от всех их вредителей. Испытания показали, что В. t. не даст токсичных остатков, безопасна для позвоночных, полезных насекомых и растений. Вред, наносимый ею окружающей среде, минимален; к тому же до сих пор не отмечали устойчивости к ней у насекомых-мишеней.
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: