Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Селекция на устойчивость растений к стрессорам

12.11.2018

Благодаря последним достижениям в геномике, физиологии, биохимии и молекулярной биологии селекционеры начинают понимать сложную природу взаимодействия генов в детерминации стресс-толерантности. Этому способствовали разработка молекулярных маркеров для картирования генов, завершение секвенирования геномов арабидопсиса, риса и кукурузы, сравнительное картирование, разработка библиотеки EST, генно-инженерные технологии и др. Однако сложность проблемы состоит в том, что абиотические стрессы непредсказуемы как по времени наступления, так и по глубине и продолжительности. Кроме того, многие стрессоры действуют одновременно. Например, во многих регионах растения страдают от совместного действия жары, засухи и засоления, что затрудняет идентификацию генотипов, устойчивых к тому или иному стрессору.

Как правило, растения реагируют на действие стрессора системно, т. е. изменением целого ряда параметров, что свидетельствует о полигенном характере устойчивости. При этом фотосинтез растения, осмотическая адаптация, целостность мембран клетки, метаболизм антиоксидантов, синтез БТШ и LEA играют ведущую роль в механизмах устойчивости. Понимание генетического контроля мультигенного количественного признака представляет часто трудную задачу, поскольку фенотип является продуктом взаимодействия генотипа со средой. Поэтому необходимо определить, насколько фенотипическая вариация контролируется генотипом, окружающей средой и взаимодействием генотипа со средой.

Использование традиционной селекции в повышении стресс-толерантности. Классическая селекция длительное время использовалась для отбора доноров ценных признаков с повышенной устойчивостью. Начиная с 1975 г. этот подход оказался весьма успешным при селекции засухоустойчивых гибридов кукурузы. В зависимости от интенсивности селекционного процесса прибавка урожая зерна в течение одного цикла селекции возросла с 59 до 233 кг/га. Интересно, что параметры водного режима растений при этом изменились незначительно. Следует подчеркнуть, что между урожайностью при оптимальной и ограниченной водообеспеченности корреляции нет, что указывает на важность отбора надежных доноров ценных признаков.

Хотя методы классической селекции, в частности при выведении засухоустойчивых генотипов, ценны, но не дают информации об: 1) участках хромосом, регулирующих вариацию каждого количественного признака; 2) плейотропных эффектах этих хромосом на другие признаки; 3) возможных причинно-следственных связях между генами. Некоторые из этих трудностей можно частично преодолеть путем использования молекулярных маркеров, которые позволяют идентифицировать QTL-локусы, определяющие выбранный признак и оценить эффекты искомого QTL-локуса на другие признаки. Например, если эффекты QTL-локуса объясняют большую долю вариации, генетические маркеры можно использовать для отбора подходящих фенотипов.

Так, идентифицированы QTL-локусы зерновой продуктивности, числа початков и числа зерен в початке у кукурузы. Однако не было обнаружено ни одного QTL-локуса, определяющего фенотипическую вариацию этих признаков более чем на 13%. Интересно, что все искомые QTL-локусы находились в разных участках генома при отличающемся водном режиме.

Анализ QTL-локусов физиологических признаков. Параметры относительного содержания воды в клетке, стабильности мембран клетки и осмотической адаптации широко используются как показатели устойчивости при действии различных стрессоров, особенно засухи, жары и засоления. Так, у риса параметры роста корня и его осморегуляции оказались тесно связаны с засухоустойчивостью. Один QTL-локус длины корня на 11-й хромосоме определял 30% изменчивости. Также обнаружены один QTL-локус объема корня и два придаточных корней. Однако из-за трудоемкости определения эти показатели редко используются при отборе, а дальнейшие исследования показали отсутствие совместной локализации признака избегания засухи и QTL-локуса морфологии корня. Поэтому улучшение ростовых параметров корня вряд ли приведет к повышению засухоустойчивости.

Обнаружен также один главный QTL-локус, связанный с осморегуляцией у риса. Этот и два других QTL-локуса, связанных с устойчивостью к обезвоживанию, негативно коррелировали с морфологией корня. Видимо, для создания засухоустойчивого сорта необходимо разорвать связь между сцепленными показателями — морфологией корня и устойчивостью к обезвоживанию.

На коллекции из 187 рекомбинантных инбредных линий ячменя, выращиваемых в условиях оптимального и ограниченного водообеспечения, обнаружены три QTL-локуса относительного содержания воды в ткани, четыре QTL-локуса осмотического потенциала и один QTL-локус осморегуляции при водном стрессе. Два хромосомных участка, предположительно контролирующие процессы осмотической адаптации, обнаружены на хромосомах 1 и 6. Установлены также эпистатические взаимодействия между несколькими QTL-локусами, но только при водном стрессе. Это указывает на возможное участие некоторых хромосомных участков в регуляции экспрессируемых признаков при водном стрессе. В другом опыте на ячмене были обнаружены потенциальные маркеры для использования в селекционных программах. Основная зона, идентифицированная в этом опыте, находилась на длинном плече хромосомы 6Н. Она была ранее определена как контролирующая относительное содержание воды в ткани, осмотический потенциал листа при водном стрессе и осмотическую адаптацию. Искомая зона на хромосоме 6Н содержит кластер генов dhn, включая dhn4 и dhn5, экспрессирующиеся в ответ на обезвоживание, холод, осмотический стресс и действие других факторов. Несколько QTL-локусов, контролирующих устойчивость и особенно морозоустойчивость, идентифицированы близко к генам дегидринов.

Локусы количественных признаков стабильности клеточных мембран изучены меньше, чем, например, QTL-локусы осморегуляции. На кукурузе и рисе идентифицированы QTL-локусы стабильности клеточных мембран, в том числе на рисе их девять.

Однако анализ QTL-локусов имеет целый ряд недостатков, в частности низкую разрешающую способность в обнаружении реального числа QTL-локусов, регулирующих экспрессию исследуемых признаков. Поэтому при малом числе маркеров (100—200) обнаруживается лишь небольшая доля QTL-локусов. Однако самый большой недостаток — дороговизна и длительность анализов. Период от первого скрещивания до реальной идентификации QTL-локусов редко бывает меньше 3 лет, продолжаясь зачастую 6—8 лет.

Клонирование генов из локусов количественных признаков. Следующий шаг после выявления QTL-локуса или хромосомного участка, связанного с интересующим признаком, — клонирование гена и подтверждение его функции. Когда доступны молекулярно-генетические карты интересующего вида и модельного растения (рис, арабидопсис) предполагаемые QTL-гены могут быть идентифицированы непосредственно на последовательности ДНК модельного объекта.

Позиционное клонирование, или клонирование на основе карты, требует повышенных усилий по фенотипированию потомства и массовому поиску дополнительных маркеров, локализованных близко к QTL-локусу. Несмотря на огромные усилия по изучению QTL-локусов устойчивости к абиотическому стрессу, лишь немногие исследования ставят своей целью реальное выделение генов, входящих в QTL-локусы. Несколько методов, включая генетический анализ экспрессирующихся маркёрных последовательностей (EST) на микрочипах, а также создание мутантов с повышенной или пониженной/утраченной (нокаут гена) активностью белка, применимы при поиске генов-кандидатов для последующего клонирования. Сочетание этих методов и подходов позволит снизить число анализируемых генов-кандидатов от сотен и тысяч до нескольких целевых генов.

Использование микрочипов. Высокопроизводительное сек-венирование EST (от англ. Expressed Sequence Tag — экспрессирующийся маркерный сайт) совместно со сравнительным анализом микрочипов может облегчить идентификацию возможных генов-кандидатов и улучшить клонирование QTL-локусов. С появлением высокопроизводительного автоматизированного секвенирования ДНК количество доступных EST быстро увеличивается. Дифференциальный дисплей был одним из первых методов параллельного скрининга на предмет различий в концентрациях кДНК- (или EST-) фрагментов, генерированных из мРНК, выделенных из образцов после различных экспериментальных воздействий. Данная технология основана на по-лурендомизированной ПЦР с использованием вырожденных праймеров и разделении амплифицированных фрагментов кДНК в геле, причем секвенирования в данном случае не требуется. Этот метод особенно полезен при изучении экспрессии генов устойчивости к абиотическому стрессу у видов, в отношении которых был проделан небольшой объем геномных исследований. Были идентифицированы три кДНК фрагмента, по-разному экспрессирующихся у подсолнечника. С помощью дифференциального дисплея был обнаружен транскрипт, появляющийся в ответ на засуху у Arachis hypogaea L.

Широкомасштабный анализ кДНК микрочипов профилей экспрессии генов устойчивости к абиотическому стрессу был проведен на модельных растениях, таких, как арабидопсис и хрустальная травка, а также на сельскохозяйственных культурах — кукурузе, капусте и сахарной свекле.

Анализ с использованием микрочипов полезен, поскольку применим для обнаружения генов, подверженных ап- и даун-регуляции, а также выключения в тканях, испытывающих стресс. Так, при помощи кДНК-микрочипов изучены экспрессионные профили растений арабидопсиса в условиях засоления, окислительного стресса и действия абсцизовой кислоты. В результате выявлены 11 генов, экспрессия которых достоверно усиливается при действии указанных факторов. Обнаружены также изменения в профилях экспрессии генов у арабидопсиса в ответ на солевой, осмотический и температурный стресс (холод). При этом 30% транскриптома обнаружило неспецифическую реакцию на стрессоры, но большинство изменений было фактороспецифическим.

Изучение экспрессионных профилей генов LEA в ответ на обезвоживание и засоление у Craterostigma plantagineum выявило профили LEA-генов, специфичные для обезвоживания и отличные от таковых для образцов, испытывавших солевой стресс. Гены табака, экспрессия которых повышается в условиях как засухи, так и теплового шока имеют пониженную экспрессию при сочетании стрессоров. Интересно, что экспрессия некоторых транскриптов, нейтральная к каждому стрессору в отдельности, повышалась при одновременном воздействии обоих факторов. Таким образом, ответ растений на одновременное действие засухи и теплового шока отличен от суммарного ответа на каждый стрессор в отдельности. Вышесказанное подчеркивает важность отбора исходного селекционного материала в полевых условиях для выведения сортов с повышенной устойчивостью к абиотическим факторам.

Анализ микрочипов способен выявить различия между линиями и в регуляции генов сложных признаков, но не позволяет связать изменчивость с конкретным фенотипом. Вместе с тем, комбинируя картирование QTL-локусов с уточнением карт при помощи микрочипов, можно локализовать предполагаемые гены интересующего фенотипа. Такой интегрированный подход позволит обнаружить предполагаемый локус или транскрипционный количественный локус (TQR), ассоциированный с интересующим фенотипом, и проверить его идентичность QTL-локусу.

Применение подобной технологии в селекции на устойчивость к абиотическим стрессорам сможет значительно снизить влияние модификационной изменчивости и сделать селекцию более быстрой и надежной.

Хотя анализ при помощи микрочипов дает ценную информацию о регуляции генов и их экспрессии в условиях стресса, он лишь в малой степени позволяет определить функции транскриптов. Более того, корреляция между уровнем мРНК и продуктами их трансляции или их биологической значимостью может быть низкой. Поэтому анализ при помощи микрочипов необходимо совместить с другими типами геномных анализов для выяснения функций и дифференциальной экспрессии транскриптов. Комбинация методов как прямой, так и обратной генетики, включая анализ нокаут-мутантов, и трансформация применяются для изучения функции гена и проверки результатов анализа при помощи микрочипов.

Мутанты. Мутанты использовались, в частности, для определения функции важных генов, обеспечивающих толерантность к абиотическому стрессу. На примере арабидопсиса разработана технология скрининга мутантов с нарушенной реакцией на низкий водный потенциал (lwrl и lwr2). Мутант lwr1 накапливал больше пролина, имел более высокую концентрацию растворенных веществ, большую осморегуляторную способность при низком водном потенциале, измененные содержание АБК, рост и морфологию. Мутант lwr2 содержал меньше пролина и отличался меньшей приспособленностью к осмотическому стрессу и соответственно большими потерями воды при дефиците влаги. Таким образом, у искомых мутантов затронуты множество аспектов клеточной осморегуляции. С помощью картирования у мутантов удалось также идентифицировать продукты генов lwr1 и lwr2. Выделены также мутанты арабидопсиса с измененной экспрессией гена AGG1, ответственного за холодостойкость, причем данный ген влияет также на время цветения.

Мутанты важны для идентификации физиологической роли мутированных генов и процессов, в которых они участвуют. Клонирование этих генов дает уникальную информацию об их работе и возможность для обратной их интродукции в растение, тем самым усиливая или уменьшая их экспрессию.

Методы трансгеноза. Во многих исследованиях, включающих оценку трансформированных мутантов, показана функция интересующего гена и механизмы его регуляции. Так, разработана техника скрининга, основанная на удлинении гипокотилей мутантов арабидопсиса, неспособных приобретать толерантность к высокотемпературному стрессу. Это было установлено точечной мутацией гена БТШ-101. Трансформация hot1 растений с помощью гена БТШ-101 дикого типа восстановила у этих растений фенотип дикого типа.

Сверхэкспрессия СОД в растениях трансгенной люцерны, выращиваемых в полевых условиях, привела к тому, что урожайность и жизнеспособность трансгенных растений значительно превосходили дикий (нетрансгенный) тип. Однако по зимостойкости трансгенные растения не превосходили контрольные растения.

Трансгенные подходы также использовались для идентификации биологически важных компонентов для повышения стресс-толерантности. Так, на трансгенном табаке (Nicotiana tabacum), запасающем полимеры фруктозы, обнаружено, что фруктанпродуцирующий табак имеет более развитые корни и лучше адаптируется к засухе. Видимо, внедрение фруктанов в сорта, не продуцирующие их, может повышать засухоустойчивость.

С целью определения роли пролина в устойчивости к осмотическому стрессу были выведены трансгенные растения арабидопсиса с антисмысловой вставкой и идентифицированы несколько форм, запасающих значительно меньше пролина и обладающих меньшей засухоустойчивостью, чем растения дикого типа. Оказалось, что при стрессе пролин в растениях является не только осморегулятором, но также влияет на процессы морфогенеза через воздействие на структурные белки клеточной стенки.

В большинстве трансгенных подходов часто используются отдельные гены и конститутивно активные промоторы, которые приводят к минимальному повышению устойчивости к стрессорам, особенно в полевых условиях. Это еще раз подтверждает, что в детерминацию устойчивости к абиотическому стрессу вовлечено множество генов. Применение комбинированных геномных подходов (мутагенез, микрочипы, молекулярные маркеры) позволит идентифицировать пути и наборы генов, необходимых для манипуляций с устойчивостью.

Интегрированный геномный подход. При интегрированном геномном подходе устойчивость к абиотическому стрессу рассматривается как полигенный признак. Исследование DREB транскрипционных факторов является хорошим примером приложения комбинированного геномного подхода для повышения устойчивости к абиотическому стрессу.

Так, трансформация А. thaliana геном DREBlA под контролем 358-промотора вируса табачной мозаики вызывает строгую конститутивную экспрессию стрессиндуцибельных генов и повышает устойчивость к заморозкам, водному и солевому стрессам. Интересно, что в отсутствие стресса развиваются «карликовые» фенотипы, что вероятнее всего вызвано сверхэкспрессией гена DREB1A. Если ген DREBlA экспрессировать под rd29А-промотором, то трансгенные растения А. thaliana показывают повышение устойчивости к стрессу и улучшение роста в нормальных условиях. Несмотря на то что обнаружено шесть целевых генов семейства DRE, индуцируемых DREB1А, было не совсем ясно, как сверхэкспрессия кДНК гена DREB1A в трансгенных растениях повышает устойчивость к стрессу. Именно поэтому для идентификации новых целевых генов DREB1A была использована технология микрочипов кДНК. Таким образом, были найдены целевые стрессиндуцибельные гены, кодирующие энзимы, которые отвечают за биосинтез осмопротекторов, таких, как пролин и сахар, мембранные белки, LEA-белки, энзимы детоксикации, шапероны, а также энзимы, вовлеченные в метаболизм фосфолипидов, протеинкиназы и транскрипционные факторы.

Группе исследователей удалось идентифицировать 26 холод-индуцибельных генов, расположенных в каскаде реакций после транскрипционного фактора DERB1A/CBF3. Исследования были направлены на поиск консервативной последовательности в промоторных областях генов, причем функции были разделены на две группы:

• белки, которые, вероятно, участвуют в обеспечении устойчивости к стрессу (LEA-белки, антифризные белки, гидрофильные белки, РНК-связывающие белки и др.);

• белковые факторы, вовлеченные в дальнейшую регуляцию передачи сигнала и экспрессию генов.

Широкое разнообразие функций генов, расположенных в каскаде реакций ниже, показывает, что транскрипционный фактор DREB1A регулирует сложную сеть экспрессирующихся генов в ответ на холодовой стресс. Подобная работа с DREВ-транскрипционным фактором на рисе привела к созданию трансгенных растений с повышенной засухо- и солеустойчивостью, но не холодоустойчивостью, при этом ингибирования роста не установлено.

В одном из недавних опытов удалось идентифицировать гены, вовлеченные в повышение экспрессии DREB. Энзим спермидинсинтаза, вовлеченный в биосинтез полиаминов, усиливает устойчивость к одновременному действию многих стрессоров и повышает экспрессию DREB-транскрипционного фактора. Трансгенные растения, обладающие сверхэкспрессией спермидинсинтазы, показывают повышенное содержание спермидина, а также повышенную устойчивость к различным стрессорам, включая холод, засоление и засуху. Анализ трансгенных растений с использованием кДЕ1К-микрочипов показал, что несколько генов, среди которых DREB1, более активно транскрибировались при холодовом стрессе.

Другой ген SRK2C, SNF-1 — связанная протеинкиназа-2, вовлеченный в фосфорилирование белков, повышает засухоустойчивость, контролируя экспрессию генов стрессового ответа, в том числе DREB-транскрипционных факторов. Е1окаут-мутанты по SRK2C проявляют гиперчувствительность к засухе в корнеобитаемом слое. Растения, несущие конструкцию CaMV35S-промотop/SRK2C-CFP проявили большую устойчивость к засухе, чем растения контрольной группы. Анализ с использованием микрочипов показал, что наблюдаемая устойчивость трансгенных растений к засухе совпадает с повышением экспрессии многих генов, ответственных за стресс-ответ, включая DREB1A/CBF3. Видимо, SRK2C способен при засухе вызывать инициацию сигналов, обусловливающих необходимую экспрессию генов.

В заключение следует сказать, что с учетом сложности и комплексности ответа растений на абиотический стресс, а также для достоверного повышения устойчивости к абиотическому стрессу в полевых условиях необходим мультидисциплинарный подход, включающий генетику, биохимию, физиологию, селекцию растений, а также растениеводство. Об этой сложности свидетельствует тот факт, что менее 1% созданных в мире трансгенных форм устойчивы к абиотическим факторам, в то время как к гербицидам и вредителям — 99%. В настоящее время все внимание направлено на улучшение понимания генетической основы устойчивости к абиотическому стрессу через использование комплекса геномных подходов, а также оценку экспрессии различных генов, кодирующих энзимы и белки различных биохимических путей, обусловливающие устойчивость к абиотическому стрессу. Этот подход, включающий QTL-анализ, оценку генома через анализ секвенированных EST и кДНК с использованием биочипов, исследование мутагенеза, а также трансгенных подходов могут обеспечить успех в понимании механизмов устойчивости к абиотическому стрессу. С помощью этих знаний будет возможна рациональная манипуляция и оптимизация признаков устойчивости для повышения продуктивности растения.

Таким образом, селекционная стратегия, направленная на повышении устойчивости к абиотическому стрессу, должна включать:

• традиционные скрещивание и отбор;

• выяснение специфичных молекулярных механизмов контроля у устойчивых и неустойчивых фенотипов с использованием геномных подходов;

• биотехнологические улучшения, включающие повышение эффективности процедур селекции и скрещивания методами функциональной геномики, использующей молекулярные пробы и маркеры для отбора среди природной или полученной в результате скрещивания популяции, а также трансформацию растений специфичными генами;

• совершенствование агротехники.
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: