Ингибиторы ацетолактатсинтетазы

Ацетолактатсинтетаза (ALS) — первый фермент на пути биосинтеза аминокислот с разветвленной цепочкой (валин, лейцин, изолейцин), функционирующий у грибов, бактерий, водорослей и высших растений. Этот фермент является первичной мишенью действия по меньшей мере четырех структурно отличающихся классов гербицидов, включая сульфонилмочевины (SU), имидазолины (IM), триазолопиримидин сульфонамиды (TP) и пиримидинил-салицаты (PC). Высокая эффективность борьбы с сорняками показывает, что ALS является основной мишенью действия гербицидов.

Первым ингибирующим ALS гербицидом стала сульфонилмочевина, которая появилась на рынке в 1982 г. и использовалась на посевах зерновых, поэтому зерновые (пшеница, рожь, ячмень, овес) относительно более устойчивы к производным сульфонилмочевины, например хлорсульфурону, чем сахарная свекла, чечевица и люцерна. Биологическая активность IM и SU исключительно высока, намного выше, чем TP, что, в частности, объясняется высокой скоростью поглощения IM в полевых условиях и низкой способностью ингибировать ALS. Разработка новых гербицидов продолжалась очень активно в последнее десятилетие XX в. В качестве примера рассмотрим специфику действия гербицидов PC.

Эти гербициды уничтожают сорняки в относительно низкой концентрации, причем до полной гибели проходит несколько недель. Первыми отмирают меристематические ткани, вызывая торможение роста у восприимчивых растений, затем наблюдается незначительный некроз завершивших рост тканей с последующим хлорозом. Подобные реакции отмечены не только на побеге, но и на корнях. Эти симптомы типичны и для других гербицидов-ингибиторов ALS.

Ингибирование роста проростков риса, суспензионной культуры моркови и хлореллы почти полностью снималось после одновременного с обработкой PC добавления трех аминокислот с разветвленной цепью. Это указывает на то, что растения из-за недостатка указанных аминокислот погибают от истощения. После обработки PC в клетках табака содержание двух аминокислот с разветвленной цепочкой снижалось, а содержание треонина, аланина и 2-аминобутирата заметно повышалось. В настоящее время отсутствуют однозначные данные о влиянии гербицидов, ингибирующих ALS, на митоз и транспорт ассимилятов.

Добавление аминокислот с разветвленной цепью также может снимать ингибирование синтеза ДНК в клеточной суспензии кукурузы, обработанной IM и ингибирование роста проростков риса, водорослей и бактерий после обработки PC. Очевидно, PC ингибирует некоторые звенья биосинтеза указанных аминокислот, особенно ALS, не затрагивая фотосинтетический транспорт электронов и лишь незначительно подавляя биосинтез хлорофилла в проростках хлопчатника. Последнее осуществляется лишь косвенно из-за дефицита аминокислот с разветвленной цепью, являющихся предшественниками некоторых ферментов, ответственных за биосинтез хлорофилла.

ALS в растениях находится в хлоропластах зрелых листьев. У арабидопсиса имеется одна копия ALS, в то время как у табака и кукурузы две, а канолы и хлопчатника — намного больше. Поскольку табак, канола и хлопчатник являются аллотетраплоидами, наличие многих генов ALS частично может быть результатом комбинации геномов, полученных от диплоидных родителей. Клонирован и охарактеризован ген, кодирующий регуляторный промотор ALS. Гены ALS были клонированы для риса, кукурузы, ячменя, хлопчатника, арабидопсиса, сахарной свеклы, рапса.

Отселектирована клеточная линия табака, устойчивая к сульфонилмочевинным и имидазолиноновым гербицидам. Вначале она была отобрана на летальных концентрациях циносульфурона, а затем на повышающихся концентрациях праймисульфурона. Фермент-мишень ацетогидоксикислая синтаза этой линии была в 50—780 раз менее чувствительна к гербицидам, чем фермент дикого типа. Определена природа устойчивости мутантного фермента, связанная с заменой пролина на серии в 196-м положении.

Проведены клонирование гена ALS, его мутагенез in vivo и in vitro и внедрение гербицидустойчивого гена в растения рапса с помощью агробактерий. Отбор по устойчивости к канамицину и непосредственно к хлорсульфурону привел к появлению гербицидоустойчивых растений.

Полевые испытания на чувствительность к сульфонилмочевинным гербицидам двух трансгенных линий показали, что в отсутствии обработки гербицидами обе линии уступали контролю по урожайности, но в присутствии 10 г/га хлорсульфурона проявляли к нему устойчивость.

Флоэмный транспорт этих гербицидов по растению ограничен, в результате чего до корней доходит мало действующего вещества, поэтому они малоэффективны в борьбе с многолетними сорняками.

При обработке двудольных культур или сорняков отдельными дозами гербицидов симптомов повреждения не наблюдается. Физиологическое повреждение некоторых зерновых культур может происходить в определенных условиях, например при низкой в момент обработки температуре, видимо, из-за пониженной скорости детоксикации гербицида. Большинство растений оправляются от временных повреждений в течение 7—10 дней.

Сорта целого ряда культур, устойчивых к ALS-ингибирующим гербицидам, были выведены как с использованием традиционного метода мутационной селекции, так и клеточной селекции in vitro (соя, кукуруза, подсолнечник, канола). Интенсивно разрабатывается гербицидоустойчивый сорт риса с нечувствительным ферментом. В большинстве случаев молекулярной основой устойчивости является мутация, связанная с заменой информации об одной аминокислоте (но в разных позициях) в ALS-гене, а в редких случаях — в двух, как и у сорных растений, устойчивых к гербицидам. Количество этих видов составляет не один десяток, и они появляются на участках (полях) с многократным повторным использованием этих гербицидов. Некоторые виды демонстрируют перекрестную устойчивость к разным видам гербицидов. Генетическая природа этого явления изучается.

После клонирования генов устойчивости к гербицидам-ингибиторам ALS они были введены в разные виды растений: табак, лен, канолу, рис, хлопчатник, горох, яблоню, сою. Эти растения, за исключением риса и сои, были трансформированы с использованием «чужих» генов ALS, взятых из Agrobacterium. В случае же с рисом и соей использовали соответственно трансформацию протопластов и бомбардировку частицами. В отличие от растений, устойчивых к гербицидам — ингибиторам ALS и полученных методами традиционной и клеточной селекции in vitro, еще не получены устойчивые растения с использованием технологии рекомбинантной ДНК (в процессе разработки находятся трансгенные хлопчатник и лен).