Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Ингибиторы глутаминсинтетазы

10.11.2018

В течение последних 30 лет стало очевидным, что ключевым ферментом ассимиляции и детоксикации аммония в растении является глутаминсинтетаза (GS). Обнаружение ингибиторов GS и создание мутантов ячменя, дефицитных по GS, показало центральную роль глутаминсинтетазы в ассимиляции азота. Стало очевидным, что GS может быть основной мишенью для новых видов гербицидов, в частности для глюфосината — неселективного гербицида для послевсходовой обработки разнообразных сорняков, открытого в 1984 г. В Северной Америке были выведены и возделываются сорта канолы и кукурузы, устойчивые к этому гербициду, и глюфосинат используется для борьбы с сорняками в их посевах.

GS в растении состоит из 8 субъединиц, молекулярная масса которых находится в пределах 38—45 кДа в зависимости от вида и субклеточной локализации соответствующей изоформы. У большинства высших растений различают цитозольную (GS1) и пластидную (GS2) изоформы с разным количественным соотношением у разных видов. Некоторые виды обладают специфической корневой изоформой (GSr), а зернобобовые — специфической клубеньковой изоформой (GSn).

Каждая субъединица фермента имеет свой активный центр для связывания субстрата. Фермент превращает глутаминовую кислоту и аммоний в глутамин путем формирования энергоемкого интермедиата — глутаминфосфата, причем для фосфорилирования необходимы АТФ и Mg2+.

Поскольку мембраны проницаемы для аммония, а также благодаря высокой концентрации ферментов в месте локализации аммония (хлоропласты и клубеньки), а также высокому сродству фермента к своему субстрату (Km = 3—5 мкМ), предотвращается утечка газообразного аммиака (NH3) в окружающую среду. С другой стороны, глутамин является транспортной формой азота в растении и, что важнее всего, — субстратом для глутаминсинтетазы.

Главным источником NH3 в растении являются фотодыхательное превращение глицин-серин и восстановление нитрита, в меньшей мере — катаболические реакции. По некоторым данным, 90% NH3, циркулирующего в растении, происходит именно из фотодыхательного цикла. Поэтому очевидно, что блокада глутаминсинтетазы будет действовать на фотосинтезирующие ткани сильнее, чем на неактивные ткани или растения в темноте.

Мутанты ячменя, дефицитные по GS2 и выделенные для условий выращивания с подавленным фотодыханием, растут нормально в среде с 2%-м содержанием O2 и 0,7%-м CO2. Вместе с тем мутанты с активностью около 40% от уровня активности дикого типа обнаруживают симптомы глубокой фитотоксичности при выращивании в нормальных атмосферных условия и на полном солнечном свету. В последнем случае содержание NH3 в листьях мутантов существенно возрастает. Интересно, что в условиях, содействующих фотодыханию, увеличение содержания NH3 коррелировало с развитием симптомов фитотоксичности, а при подавленном фотодыхании подобных симптомов не было, хотя содержание NH3 было достаточно высоким.

В конце 1960-х гг. обнаружен трипептид, продуцируемый Streptomyces viridochromogenes и обладающий ингибиторным эффектом на бактерии. Пептид состоит из двух остатков аланина, связанных с уникальной аминокислотой, названной фосфинотрицин. Позже трипептид получил название биалафос. Гипотеза, согласно которой фосфинотрицин может быть потенциальным ингибитором GS из-за структурной аналогии с глутаматом, полностью подтвердилась на бактериях.

Фосфинотрицин — эффективный гербицид для послевсходовой обработки сорняков, действующий практически на все их виды и не обладающий селективностью по отношению к полевым культурам. На рынке он известен под товарным знаком «глюфосинат аммония». За прошедшие 20 лет он оказался весьма эффективным на плантациях винограда, в плодовых садах и в поле.

Глюфосинат действует на GS в два этапа. На первом (обратимом) этапе ингибитор конкурирует с глутаматом за место связывания на ферменте, на втором этапе фосфорилированный фосфинотрицин необратимо связывается с ферментом. Каждая из восьми субъединиц GS способна присоединять одну молекулу фосфинотрицина.

Значения Ki для ингибирования активности GS1 и GS2 глюфосинатом отличались мало и составили: для кукурузы (42% активности GS1 и 58% GS2) — 2 мкМ для GS1 и 4 мкМ для GS2, а для ячменя (9% активности GS1 и 91% GS2) — 33,5 мкМ для GS1 и 6 мкМ для GS2.

Исследователям удалось отобрать виды растений с различной чувствительностью к глюфосинату in vivo и определить соотношение GS1/GS2, а также Ki для выделения изоэнзимов. Значения Ki менялись в маленьком диапазоне и не коррелировали с разной чувствительностью этих видов к гербициду.

Временной ход развития симптомов после обработки сорняков глюфосинатом зависит от их вида и условий среды. В течение 1—2 дней на листьях появляется бледно-зеленая или желтоватая окраска, часто начинающаяся в межжилковой зоне. Указанные первичные симптомы перерастают в последующем в хлороз листьев, а затем в высыхание (некроз). Такая последовательность событий указывает на нарушение функционирования мембран вскоре после обработки гербицидом. Полная гибель сорняков наступает через 1—2 нед.

У растений, находящихся на свету в течение нескольких часов после обработки глюфосинатом, отмечалось заметное увеличение концентрации NH3H снижение концентрации глутамина, глутамата, аспарагина, аспартата, аланина, глицина и серина в тканях листьев. Одновременно повышалось содержание ароматических аминокислот с разветвленной боковой цепью, а также лизина и аргинина. Параллельно как у C3-, так и у С4-видов снижалась ИФ, хотя накопление аммиака и ингибирование фотосинтеза у последних протекает медленнее.

У обработанных растений на свету содержание NH3 через 4 ч после обработки было на порядок, а через 24 ч на 2 порядка выше, чем у контрольных растений. Развитие видимых симптомов фитотоксичности и накопление аммиака у растений, перенесенных в темноту сразу после обработки, происходило намного медленнее, но резко ускорялось при перенесении растений на свет через 1 сут. Эти данные согласуются с фактами, что восстановление нитритов до аммиака и образование его при фотодыхательном превращении глицина в серии — светозависимы и что ингибирование GS препятствует ассимиляции аммония при его реассимиляции в органические компоненты. Известно, что высокая концентрация NH3 токсична для растения и может вызвать падение градиента pH на тонопласте, что, в свою очередь, приводит к нарушению мембранного транспорта и соответственно цитотоксическому эффекту. Вышесказанное подтверждается полевыми наблюдениями, согласно которым обработка глюфосинатом наиболее эффективна в яркий солнечный день. Интересно, что содержание белка в растениях через 2 сут после обработки глюфосинатом снижалось на 40%, что обусловлено ингибированием цикла глутаминсинтетазы/глутаматсинтазы и катаболизмом белков.

Весьма интересен ингибирующий эффект глюфосината на ИФ. В отличие от фенилмочевины, триазинов и других ингибиторов ФС II глюфосинат непосредственно не вмешивается в фото-синтетический транспорт электронов. В то время как фиксация CO2 ингибируется в течение нескольких часов после обработки гербицидом, фотосинтетический транспорт электронов в хлоропластах, извлеченных из листьев сразу после опрыскивания, не снижался по меньшей мере еще 48 ч, т. е. изменения в фотосинтетическом аппарате носят вторичный характер. Основной же причиной ингибирования ИФ, по мнению многих исследователей, может быть блокирование или ограничение потока углерода через фотодыхательный цикл, исчерпание доноров NH3, необходимых для превращения глиоксиловой кислоты в глицин.

Таким образом, гибель растений, обработанных глюфосинатом, происходит в результате:

• нарушения функций мембран в результате накопления NH3;

• снижения биосинтеза пептидов, белков и нуклеотидов из-за недостатка доноров органического азота для реакций трансаминирования или трансамидирования;

• усиления протеолиза;

• быстрого подавления фотосинтетической фиксации CO2 вследствие нарушений в фотодыхательном цикле с последующим повреждением аппарата фотосинтеза.

Хотя селекция мутантов in vitro представляет собой один из эффективных путей создания трансгенных форм культурных растений, устойчивых к гербицидам, этот подход не оказался результативным по отношению к глюфосинату. При этом следует подчеркнуть, что оказалось возможным отобрать клеточные линии люцерны в 20 раз устойчивее к фосфинотрицину, чем исходная. Однако все попытки регенерировать растения из мутантных клеточных линий окончились безрезультатно. Эти данные, а также факт, что многолетнее повторное использование глюфосината под плодовые и полевые культуры не привело к возникновению сорных растений, устойчивых к данному гербициду, указывает на то, что если бы даже точечная мутация гена GS привела к появлению мутантного фермента с пониженным сродством к фосфинотрицину, мутанты не выжили бы из-за низкого сродства к глутамату и низкой ферментативной активности. Попытка сверхэкспрессии GS1 люцерны в клетках табака привела к созданию форм табака с высоким содержанием белка GS люцерны, повышенной активности GS в побегах и листьях, но умеренной устойчивостью к глюфосинату. Видимо, цитозольная экспрессия GS1 люцерны не смогла предотвратить частичную инактивацию GS2 в хлоропластах, что и привело к видимым гербицидным симптомам.
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: