Ингибиторы протопорфириногеноксидазы

Хлорофилл и гем в фотосинтетических организмах синтезируются по тетрапиррольному пути. В качестве первого предшественника служит 5-аминолевуленовая кислота (АЛК), образующаяся из глутамата по С5-пути. В дальнейшем, через серию реакций, она превращается в протопорфирин IX — последнее промежуточное соединение между гемом и хлорофиллом. Встраивание Fe2+ в протопорфирин IX образует протогем, в то время как хелатирование Mg2+ — первый этап хлорофильной ветви. В пластидах происходит синтез хлорофилла и гема. Однако активность ферментов пути синтеза гема — протопорфириногеноксидазы и феррохелатазы — обнаружена в митохондриях, т. е. протопорфириноген IX распределен между пластидами и митохондриями. Таким образом, заключительные этапы синтеза тема в растении проходят параллельно и в митохондриях, и в пластидах.

Протопорфириногеноксидаза — фермент при синтезе тетрапиррола, находящийся перед разветвлением цепи реакций в направлении синтеза хлорофилла или тема. Этот фермент является мишенью для многих классов гербицидов, включая дифениловые эфиры, циклические имиды и тиадиазолидины. Обработка растений этими гербицидами приводит к ПОЛ клеточных мембран и обесцвечиванию тканей на свету, что дало им название пероксидирующих фитообесцвечивающих гербицидов.

Обработанные гербицидами ткани растений накапливают протопорфирин IX. Предполагается, что излишек протопорфириногена выводится из пластид в цитоплазму и не метаболизируется митохондриальной протопорфириногеноксидазой, ингибированной гербицидом, а окисляется до протопорфирина IX в цитоплазме (в дополнение к пластидам) с помощью соответствующей оксидазы, не чувствительной к гербицидам. Активность этой оксидазы обнаружена в плазмалемме и в эндоплазматическом ретикулуме. Кроме того, пероксидаза тоже может окислять протопорфириноген.

Накопление протопорфирина и соответственно приостановка биосинтеза хлорофилла и тема — достаточно быстрые процессы. Кроме того, протопорфирин IX в присутствии света и молекулярного кислорода генерирует АФК, атакующие ненасыщенные жирные кислоты в клеточных мембранах. Это приводит к текучести мембран (утечка воды и ионов), разрушению пигментов и в последующем — к некрозу листьев.

Гербициды данного класса обычно вносятся как до, так и после появления всходов. Некоторые из этих гербицидов используются в сельском хозяйстве более 30 лет. Большинство из них плохо транспортируется по листьям, обладают плохой избирательностью, часто не доходят до точек роста, что снижает их эффективность в борьбе с сорняками.

Первый растительный ген протопорфириногеноксидазы был выделен из арабидопсиса. Он характеризовался лишь незначительной гомологичностью с человеческим и мышиным генами. В 2000 г. были выделены и секвенированы кДНК пластидной протопорфириногеноксидазы цикория и шпината.

Для получения растений, устойчивых к гербицидам-ингибиторам протопорфириногеноксидазы, использовались несколько стратегий. Резистентность может быть достигнута путем изменения гербицидсвязующего сайта фермента и предотвращения стабильного связывания специфического гербицида. Были отобраны мутантные культуры клеток в среде, содержащей ингибиторы протопорфириногеноксидазы, для идентификации генов устойчивости. Таким путем в 1999 г. были выделены клеточные линии табака, устойчивые к искомым ингибиторам. Единственная точка мутации — Вал 389 Mem пластидной изоформы обеспечила устойчивость мутанта к ингибитору протопорфириногеноксидазы. Трансгенные растения, в которых осуществлена сверхэкспрессия пластидной изоформы протопорфириногеноксидазы арабидопсиса, показали устойчивость к ацифлуорфену. Сверхпродуцирование митохондриальной протопорфириногеноксидазы в клеточной культуре мутантного табака тоже повышала устойчивость к ингибиторам.

Ингибиторы протопорфириногеноксидазы и антиоксидантная стресс-реакция растений. Генерация АФК в растениях усиливается по мере накопления тетрапиррольных интермедиатов, поэтому биосинтез тетрапирролов находится под сильным регуляторным контролем, чтобы, в частности, избежать их избыточного накопления. Негативные последствия этого для растений хорошо заметны после обработки гербицидами, ингибирующими протопорфириногеноксидазу. Активированный светом протопорфирин IX генерирует АФК, включая синглетный кислород и супероксид-анион.

Растения защищают себя от токсичного действия АФК с помощью ряда ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов. Однако это не всегда удается, особенно при избыточных количествах АФК. Есть многочисленные данные о связи антиоксидантной системы и толерантности растений к гербицидам дифениловых эфиров, в частности к оксифлуорфену. При этом рис среди целого ряда культур показал максимальную устойчивость, а гречиха — минимальную. Однако оба вида накапливали сравнимое количество протопорфирина IX. Вместе с тем активность СОД, каталазы и содержание глутатиона у риса были намного выше, чем у других культур. Антиоксидантная способность гречихи была минимальной и не повышалась после обработки гербицидом. На растениях табака, обработанных оксифлуорфеном, обнаружены индукция активности антиоксидантных ферментов и повышение уровня мРНК. На растениях арабидопсиса, экспрессирующих ген антисмысловой протопорфириногеноксидазы, появлялись некротические пятна на листьях и увеличивался эндогенный уровень салициловой кислоты. Обработка диких типов растений избирательными концентрациями гербицидов-ингибиторов протопорфириногеноксидазы также индуцировала защитные реакции, которые обеспечивают повышенную устойчивость к инфицированию Peronospora paracritica. Таким образом, генетическое или химическое нарушение метаболических путей может привести к индукции целого рода защитных реакций. Обработка суспензионной культуры сои салициловой кислотой (индуктор защиты от патогенов) сильно стимулировала удельную активность антиоксидантных ферментов и повышала защитную активность против ПОЛ, вызванного оксифлуорфеном. Это указывает на важную роль салициловой кислоты в регуляции ответа на окислительный стресс.