Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Генетическая модификация растений с целью повышения устойчивости к алюминию

10.11.2018


Для повышения устойчивости растений к алюминию путем эктопической экспрессии генов используют два различных подхода: экспрессию генов, индуцируемых воздействием алюминия, и экспрессию генов, повышающих выработку органических кислот.

В одном из опытов из генов, идентифицированных ранее по эффекту на устойчивость к алюминию и индуцируемых им, были экспрессированы гены растений: 11 в дрожжах и 9 в арабидопсисе. Два гена, кодирующие предполагаемый ингибитор диссоциации GDP и медьсвязывающий белок арабидопсиса, отвечали за устойчивость к алюминию в дрожжах. Эти же гены повышали устойчивость трансгенного арабидопсиса при сверхэкспрессии генов глутатион-8-трансферазы и пероксидазы табака. Экспрессия трансгенов повысила накопление алюминия в апексе корней и ослабила окислительный стресс от его воздействия. Для подавления роста корней проростков дикого типа на 60% требовалось воздействие алюминия в концентрации 200 мкмолей. Из-за формирования нерастворимых комплексов с компонентами среды фактическая концентрация свободного алюминия была, видимо, даже ниже. В аналогичных условиях растения, экспрессирующие трансгены, отличались более активным, чем растения дикого типа, ростом корней. Исключительно важно, что в растениях, экспрессирующих трансгены глутатион-S-трансферазы или ингибитора диссоциации GDP, накопление каллозы в кончиках корней под воздействием алюминия было ниже, чем у дикого типа. Аналогичная картина наблюдалась у растений, экспрессирующих гены пероксидазы табака или медьсвязывающего белка арабидопсиса, что указывает на пониженную для них токсичность алюминия. Действительно, содержание алюминия в апексах корней в последнем случае было значительно ниже, чем у растений дикого типа. Интересно, что у растений, экспрессирующих два трансгена, наблюдался аддитивный эффект с геном пероксидазы табака, отвечающим за наиболее значительное повышение устойчивости к алюминию. Так, рост корней растений, экспрессирующих ген пероксидазы табака и дополнительный трансген, при концентрации алюминия 200 мкМ снижался в среднем на 20%, тогда как у растений дикого типа — на 60%. Таким образом, сверхэкспрессирование алюминийиндуцируемых генов может быть эффективной стратегией повышения устойчивости растений.

Поиск новых генов, детерминирующих устойчивость к алюминию, продолжается. Так, проверена способность кДНК кончиков корней у устойчивого генотипа пшеницы ЕТЗ, подвергшегося воздействию алюминия, проявлять требуемую устойчивость в клетках дрожжей. Среди 2 млн трансформантов дрожжей удалось идентифицировать 6 уникальных кДНК, повышающих устойчивость клеток к алюминию. У одного из клонов кДНК имела значительное сходство с последовательностью гена фосфатидилсеринсинтазы (TaPSS), вовлеченного в биосинтез фосфолипидов. Сверхэкспрессия кДНК TaPSS в арабидопсисе повысила количество фосфатидилсерина в листьях, изменив фосфолипидный состав, что проявилось в приостановке роста, некротических повреждениях, а также в изменении формы листьев. Однако, несмотря на то что данный фермент может участвовать в обеспечении устойчивости плазматической мембраны пшеницы к алюминию, сверхэкспрессирование его в табаке не сказалось на устойчивости.

Корни устойчивых растений пшеницы выделяли белок с молекулярной массой 23 кДа, связывающий алюминий и обладающий сходством с клонированной кДНК Mn-СОД у пшеницы. Трансгенные растения Brassica napus со сверхэкспрессией этой кДНК обнаружили повышенную устойчивость к алюминию в водной культуре. Так, рост корней у контрольных растений дикого типа в растворах, содержащих 100 мкМ алюминия, снижался примерно на 40%, тогда как у трансгенных растений лишь на 10—20%. Повышенной устойчивости последних соответствовало пониженное накопление в их корнях каллозы и ослабление окислительного стресса.

Продолжается поиск гена устойчивости, функцией которого могла бы быть активация синтеза соединений, в частности органических кислот, хелатирующих алюминий в корнях растений. Так, ген цитратсинтазы (ЦС) из Pseudomonas aeruginosa был сверхэкспрессирован в табаке и папайе. Как известно, цитратсинтаза переводит оксалоацетат в цитрат и является ключевой в регуляции синтеза других органических кислот в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК). Из органических кислот, участвующих в нормальном дыхательном метаболизме, цитрат имеет наивысшую способность связывать алюминий. Однако успех в повышении синтеза цитрата и его выделении корнями путем сверхэкспрессии ЦС был непостоянным. При экспрессии трансгена цитратсинтазы в табаке установлено 2—3-кратное повышение активности ЦС и почти 10-кратное — концентрации цитрата в корнях по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями. При этом содержание цитрата в корневых выделениях трансгенных растений повысилось до 4 раз. Однако эти результаты не всегда удается воспроизвести. Так, не обнаружено заметного повышения активности ЦС в растениях табака даже с высокой аккумуляцией белка ЦС Pseudomonas aeruginosa (до 2% всего белка цитозоля). Видимо, большинство синтезированных белков не были каталитически активными вследствие возможной неправильной их упаковки или агрегации в клетках растений, поскольку нуклеотидная последовательность гена в трансгенных растениях была идентична оригинальной последовательности Pseudomonas aeruginosa. Вместе с тем как трансгенные формы, так и растения табака дикого типа отвечали на алюминиевый стресс выделением цитрата корнями, однако его количество в корнях, как и количество выделяемого корнями цитрата, различались незначительно. He было также обнаружено никаких изменений в устойчивости у двух линий трансгенной люцерны, экспрессирующих трансген цитратсинтазы. Вышеупомянутая устойчивость к алюминию у трансгенного табака может быть связана с явлением сомаклональной изменчивости. Таким образом, пока нет оснований считать, что экспрессия бактериального гена ЦС является надежной стратегией повышения устойчивости к алюминию.

Ген ЦС растения, экспрессированный в трансгенном арабидопсисе, напротив, содействовал повышению устойчивости при выращивании растений как на питательном растворе, так и на кислой почве. Максимальное значение активности ЦС в трансгенных линиях растений было примерно в три раза выше, чем у контрольных растений. При этом содержание цитратов в корневых выделениях у трансгенных линий при действии алюминия было выше, чем в контроле, а количество цитрата коррелировало с активностью ЦС. Трансгенные линии продуцировали белок, специфично узнаваемый антителом к ЦС моркови. При этом две линии трансгенных растений продемонстрировали более активный рост корней по сравнению с диким типом, выращиваемым в качестве контроля на питательном растворе с концентрацией алюминия 0,5 или 1мкМ. Аналогичная тенденция наблюдалась на кислых почвах с низкой доступностью фосфора и токсичной концентрацией алюминия. Однако сверхэкспрессия гена ЦС в растениях табака не повысила синтез цитрата и их устойчивость к алюминию. У табака, как, возможно, и у других растений, синтез цитрата не чувствителен к изменениям энзиматической активности. Видимо, другие факторы тоже могут контролировать выделение цитрата.

Сверхэкспрессия растительных генов двух других ферментов, вовлеченных в синтез органических кислот — фосфоенолпируват-карбоксилазы (ФЕПК) и малатдегидрогеназы (МДГ), — теоретически тоже может повысить синтез органических кислот и устойчивость к алюминию. ФЕПК катализирует образование щавелево-уксусной кислоты (ЩУК) и неорганического фосфата из ФЕП и CO2. Эта реакция играет ключевую роль в совокупности нефотосинтетических процессов и в значительной мере в азотфиксации у бобовых, где ФЕПК поставляет углерод для синтеза малата и аспартата. Скорость синтеза цитрата определяется доступностью ЩУК и ацетилкоэнзима А. Повышение активности ФЕПК и, следовательно, пулов ЩУК может увеличить синтез органических кислот в корнях растений.

МДГ катализирует обратимый переход ЩУК в малат. Вследствие полифункциональности этого фермента в растительном метаболизме (поддержание баланса pH, устьичные движения, дыхание, b-окисление жирных кислот, функционирование корневых клубеньков) существует широкое разнообразие его форм. Так, были клонированы кДНК пяти форм МДГ люцерны: цитоплазматической, глиоксисомальной, митохондриальной, хлоропластной и уникальной клубеньковой формы — кМДГ. Последняя отличается исключительно высокой скоростью оборота при образовании яблочной кислоты, составляющей 15711/мин (560/мин у цитоплазматической формы). Очевидно, что катализируемая кМДГ реакция тесно связана с синтезом малата, и уникальные особенности этого фермента делают его наиболее вероятным кандидатом для повышения синтеза малата в корнях.

Когда у десяти линий люцерны, содержащих конструкцию 35S::кМДГ, и у девяти линий с конструкцией 35S::кФEПK провели иммуноблоттинг белков и ферментативные определения, оказалось, что из первой группы были идентифицированы шесть линий с повышенной активностью МДГ, а из второй группы — лишь одна линия с повышенной активностью ФЕПК. Отобранные семь линий отличались также повышенным содержанием органических кислот в тканях корня. В кончиках корней растений с трансгеном кМДГ повысилась концентрация цитрата, оксалата, малата, сукцината и ацетата по сравнению с нетрансформированной формой, используемой в качестве контроля. Линия с трансгеном ФЕПК превосходила контроль по содержанию оксалата и малата.

При выращивании в песчаной культуре корни растений трансгенных линий, несущих конструкцию с геном кМДГ, выделяли повышенное количество цитрата, оксалата, малата, сукцината и ацетата по сравнению с нетрансформированной линией. Вместе с тем линия с трансгеном ФЕПК не показала значительного повышения содержания органических кислот в корневом экссудате. В кислом питательном растворе растения, экспрессирующие трансгены обоих ферментов, отличались более активным ростом корня, сравнимым с таковым у контрольной нетрансформированной линии при концентрациях алюминия 20, 50 и 100 мкМ. На кислой почве растения с трансгеном кМДГ имели преимущество по росту корня и стебля над контрольными растениями и линией, содержащей ген ФЕПК. Видимо, экспрессия кМДГ способствует устойчивости к кислым почвам, о чем свидетельствуют опыты и с другими видами полевых культур. Так, экспрессия кМДГ люцерны в трансгенном овсе повышает устойчивость последнего к алюминию в водной культуре.

Хотя механизм устойчивости трансгенных форм люцерны или овса, экспрессирующих кМДГ, не совсем ясен, выведение алюминия из корней может быть обусловлено как экссудацией органических кислот, так и хелатированием алюминия органическими кислотами в клетках корня. До сих пор не ясно, выделяют трансгенные растения алюминий или же, напротив, накапливают.

Повышения устойчивости можно достичь путем комбинирования трансгенов ферментов, участвующих в синтезе органических кислот, таких, как кМДГ с ЦС или ФЕПК, или сочетанием генов синтеза органических кислот с генами устойчивости к окисли-тельному стрессу. До настоящего времени во всех экспериментах по повышению синтеза органических кислот использовались конститутивные промоторы. Поскольку апекс корня является мишенью токсического воздействия алюминия, экспрессия трансгенов с использованием специфичных к кончику корня промоторов может повысить устойчивость. Однако пока неизвестно, каковы последствия повышенного синтеза органических кислот в корнях растения для ферментов углеродно-азотного метаболизма. Кроме того, повышенная экссудация органических кислот может также влиять на ризосферные бактерии и доступность элементов питания.

Характер токсического действия алюминия очень сложен. Функциональные отклонения, глубокие нарушения в азотном, углеводном и фосфорном обмене, подавление ростовых процессов приводят к морфологическим изменениям и к резкому уменьшению продуктивности растений. Ежегодный недобор урожая сельскохозяйственных культур на кислых почвах в пересчете на зерно составлял в бывш. СССР 15—20 млн тонн. Слабое кущение злаковых растений, нарушения в закладке генеративных органов и как результат уменьшение размеров колоса или метелки, слабый налив зерна — следствие токсического действия ионов алюминия на зерновые культуры. Сроки прохождения растениями этапов органогенеза изменяются незначительно, но размеры зачаточного колоса снижаются уже в самый ранний период. Формирование белкового комплекса зерновки в присутствии подвижных форм Al3+ резко нарушается.

Бразильские ученые попытались оценить влияние алюминия на урожай и его качество в субпопуляции из 162 рекомбинантных инбредных линий овса, отобранных по признаку устойчивости. Устойчивость к алюминию в популяции контролировалась одним главным доминантным геном, причем устойчивые генотипы несли аллели А1[А]А1[А], чувствительные — А1[а]А1[а]. Никаких значимых эффектов А1[а] аллеля на урожай и его качество не установлено.

В одном из опытов путем бэккроссирования были получены линии сортов озимой пшеницы Чисхолм (Chisholm) и Сенчери (Century), которым был передан ген устойчивости к алюминию от сорта Атлас 66. На произвесткованной почве устойчивый и чувствительный генотипы не отличались по урожайности, демонстрируя нейтральный эффект гена устойчивости сорта Атлас 66 в отсутствие токсичного действия алюминия. На почвах, где насыщение алюминием на непроизвесткованных почвах превышало 30%, устойчивые к алюминию генотипы сорта Сен-чери демонстрировали увеличение продуктивной кустистости почти в два раза, однако прибавки урожая зерна не установлено. Вместе с тем урожайность неустойчивого сорта Чисхолм после введения гена устойчивости к алюминию увеличилась на 50—74%. Полученные данные показывают, что степень влияния устойчивости к алюминию на урожайность в значительной степени зависит от почвенных условий и генетических особенностей растения.

Имя:*
E-Mail:
Комментарий: