Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Методы отбора устойчивых к алюминию форм растений

10.11.2018

Для идентификации устойчивых растений используются вегетационные методы: почвенной, песчаной и водной культур. В них обычно оценивается степень подавления роста корней или накопление в них алюминия. Кроме того, используются некоторые методы in vitro, позволяющие оценить рост культуры клеток на содержащей алюминий среде.

Вегетационные методы. Метод почвенной культуры. Почвенные культуры с токсичным уровнем содержания обменного алюминия использованы при изучении устойчивости у целого ряда культур: люцерны, ячменя, овсяницы, сорго, сои, пшеницы и др. Обычно растения выращивают в сосудах с кислой почвой примерно в течение одного месяца или в полевых условиях в течение вегетационного периода, после чего сравниваются сухая масса корня, побега и концентрация алюминия в тканях растения в опытном варианте и контроле (при нетоксичном уровне pH). Метод позволяет оценить растения как в ранние фазы развития, когда рост корней наиболее чувствителен к действию стрессора, так и в более поздние фазы, когда дефицит питательных веществ и/или засуха могут повлиять на рост растения. Однако подобный метод может быть слишком чувствительным для неустойчивых форм. Так, при использовании непроизвесткованной почвы с токсичным уровнем алюминия, оказалось невозможным разделить растения сорго по степени устойчивости. Однако это удалось сделать при повышении pH до 4,3 путем известкования почвы. Похожая ситуация наблюдалась также в случае с твердой пшеницей. Продуктивность пшеницы на кислых почвах в большей степени зависит от уровня насыщенности почвы алюминием и другими токсичными минералами, такими, как марганец, чем от уровня pH, так как сорта, устойчивые к алюминию, могут и не быть устойчивыми к марганцу.

Для скрининга устойчивых генотипов мелкосемянных культур, плохо прорастающих на кислых почвах, используют тонкий слой кислой почвы, помещенной на слой агара. Виды бобовых трав отличались по продолжительности периода, необходимого для прорастания в этих условиях, что указывает на их различную устойчивость к алюминию. Однако кислые почвы не всегда доступны для опытов.

Метод песчаной культуры. Позволяя контролировать количество поступающих в растение алюминия и других минеральных веществ, метод требует значительных затрат времени. Растения поливают дважды в день, первый раз кислым раствором с алюминием, второй — кислым питательным раствором. Результаты, полученные в песчаной и водной культурах, оказались схожими и более точно отражали агрономическую устойчивость к алюминию, оцениваемую по урожайности в полевых условиях.

Метод водной культуры. Метод также широко используется для идентификации устойчивости сельскохозяйственных культур (пшеницы, ржи, кукурузы, риса, люцерны, вигны, сои, томата, рапса) к алюминию. При этом проростки несколько дней выдерживают на среде с низким уровнем pH в присутствии 0,1мМ CaCl2, а затем помещают в содержащий алюминий раствор. Масса корней оценивается еженедельно и сравнивается с контрольными растениями. К достоинствам данного метода можно отнести достаточную быстроту определения, а также возможность оценки большого числа растений в ограниченном пространстве за относительно короткий период времени. Недостаток метода заключается в том, что растения с относительно низкой скоростью роста могут казаться более устойчивыми, чем они являются на самом деле, потому что степень подавления скорости роста корня у них меньше, чем у более активно растущих растений. Кроме того, водная культура не подходит для выращивания вегетативно размножаемых растений или растений, у которых устойчивость к алюминию проявляется лишь в фазе генеративного развития. Важно также иметь в виду, что, поскольку алюминий может образовать комплексы с фосфором и серой при любом уровне pH, использование полноценного питательного раствора невозможно.

Метод водной культуры не позволяет также отделить ингибирование роста корней вследствие понижения уровня pH от индуцированного собственно токсическим действием алюминия. В результате многие растения, чувствительные к кислой среде, включая арабидопсис, фасоль, горох и сою, но толерантные к алюминию, могут быть оценены как чувствительные к нему. Однако оценка ростовых параметров корней в репарационный период (после прекращения действия алюминия) позволяет успешно идентифицировать устойчивые к алюминию генотипы среди форм растений, неустойчивых к кислотности почвы.

Колориметрические методы. Альтернативой измерению ростовых параметров является метод окрашивания корней гематоксилином, служащим индикатором потребления алюминия чувствительными растениями. При этом увеличение интенсивности окрашивания и соответственно повышенный уровень поглощения алюминия отражали пониженную устойчивость. Согласно этому методу, проростки выдерживают в кислом растворе алюминия в течение 1—24 ч, промывают водой для удаления его излишков, окрашивают в 0,2% растворе гематоксилина с добавлением 0,02% NaIO3 или KI. Затем снова промываются водой и лишь после этого оценивают интенсивность пурпурной окраски. Особенно важно, что отобранные растения можно довести до хозяйственной спелости урожая. Однако данный метод позволяет скорее качественно, нежели количественно оценить содержание алюминия в корнях. Недостатком данного метода является также то, что иногда окрашивание происходит в отсутствие алюминия или не происходит вовсе, несмотря на его высокую концентрацию.

Окрашивание люмогаллионом является более точным методом обнаружения алюминия в кончиках корней, особенно у чувствительных растений, причем алюминий обнаруживается в ядрах клеток коры на расстоянии 1—2 мм от кончика корня сои уже после 15-минутной экспозиции. На расстоянии 1 мм от корневого чехлика алюминий накапливается в симпласте, а на расстоянии 2 мм — в клеточной стенке и на периферии клеток. После 30-минутной экспозиции алюминий обнаруживается уже в протоксилеме. Алюминий накапливается также в клетках коры и эпидермиса корневого чехлика пшеницы. У кукурузы алюминий быстро поступает в клетки корневого чехлика устойчивых сортов, что коррелирует с индуцированным алюминием временным ингибированием роста корня. Удлинение корня возобновляется после 24-часового воздействия алюминия, видимо, необходимого для изменения экспрессии генов.

Хотя водная культура с применением окрашивания или без него достаточно эффективна при идентификации устойчивых генотипов, далеко не всегда устойчивость к алюминию в водной культуре тесно коррелирует с таковой на кислых почвах. Так, различия между экотипами арабидопсиса по ОСР, обнаруженные в водной культуре, сохранялись и при выращивании их на кислой почве. Устойчивые линии трансгенной люцерны тоже отличались более активным ростом корней по сравнению с контрольными растениями при выращивании как в водной культуре, так и на кислой почве. Растения рапса, выращенные на кислой почве в полевых условиях, напротив, обнаружили более высокую ОСР, чем в водной культуре, а растения томата — примерно одинаковую.

Оптимальная концентрация алюминия для скрининга устойчивых генотипов сильно зависит также от вида растения. Рассмотрим в качестве примера рожь и пшеницу. Поскольку рожь является более устойчивой, чем пшеница, то оптимальная концентрация алюминия для ржи будет выше, чем для пшеницы. Указанная концентрация зависит также от задач, поставленных при скрининге. Если последний является частью текущей селекционной программы и цель исследования — идентифицировать наиболее устойчивые растения, можно использовать более высокие концентрации алюминия. Если же необходимо количественно охарактеризовать устойчивые генотипы, нужно применять более низкие концентрации алюминия, чтобы выделить генотипы с зародышевой плазмой, несущей признак устойчивости. Так, при использовании метода окрашивания гематоксилином для разделения популяций ржи наиболее подходящей оказалась концентрация алюминия 50 мг/л. На фоне таких высоких концентраций алюминия отрастание корней отмечено лишь у небольшого числа растений. В случае же определения длины и индекса устойчивости (ИУ) корня ранжировать генотипы по устойчивости удалось при концентрациях алюминия на порядок ниже.

Действительно, устойчивость к алюминию, определяемая по линейному росту корней в условиях алюминиевого стресса, является результатом сочетания собственно устойчивости (действие аллелей устойчивости) и силы роста корня. Таким образом, ИУ должен лучше отражать воздействие алюминия на корень, поскольку при этом нивелируются исходные различия в росте корня между генотипами, что позволяет стандартизировать их сравнение. Используя последний метод удалось идентифицировать пять различных по степени устойчивости к алюминию классов растений, каждый со специфической комбинацией вкладов в этот признак силы роста корня и собственно устойчивости к алюминию. При этом оказалось, что, измеряя просто длину корня без расчета индекса ее устойчивости, невозможно разделить генотипы на классы, сильно отличающиеся по степени устойчивости. При этом, естественно, семена и проростки должны быть калиброваны, чтобы по возможности максимально исключить фактор внутрипопуляционной разнородности, зачастую превышающей межсортовую вариацию.

Метод окрашивания гематоксилином в силу своей простоты и дешевизны весьма эффективен при работе с большими популяциями, полученными от хорошо адаптированной зародышевой плазмы. Однако при оценке зародышевой плазмы с аллелями, определяющими высокую степень устойчивости к алюминию, но невысокую хозяйственную ценность, предпочтительнее определение индекса устойчивости корней. Это имеет место в молекулярно-генетических исследованиях, требующих точной количественной оценки устойчивости к алюминию, а также при изучении редкой (экзотической) зародышевой плазмы. Затем идентифицированные аллели устойчивости с помощью методов возвратной селекции могут быть введены в генотипы, обладающие полезными агрономическими признаками.

Методы in vitro. Методы культуры клеток используются для скрининга устойчивых генотипов, создания и идентификации сомаклональных вариантов с повышенной устойчивостью, а также для изучения реакции клеток на алюминиевую токсичность. Представляется, в частности, перспективным применение культуры тканей для создания чувствительных мутантов из устойчивых растений. Это дает возможность использовать для идентификации и характеристики генов устойчивости формы с близкими генотипами. Однако для практического использования селекции in vitro с целью создания устойчивых сортов необходимо, чтобы степень устойчивости на уровне культуры клеток и всего растения тесно коррелировала, что собственно и было показано для люцерны. При этом устойчивые формы можно идентифицировать путем сравнения роста каллуса на кислой среде в присутствии и отсутствии алюминия. Видимо, как в культуре клеток, так и на уровне целого растения функционируют аналогичные механизмы устойчивости. Однако клеточная селекция не всегда экономически более эффективна, чем традиционная селекция на кислой почве или отбор устойчивых форм растений в водной культуре.

Разработка новых сред с разной концентрацией фитотоксичных ионов алюминия для культуры клеток также может представлять определенные трудности, поскольку алюминий способен взаимодействовать с другими ионами с образованием нерастворимых осадков. Поэтому фактические концентрации алюминия в агаризованной среде могут быть значительно ниже, чем добавленные в среду.

Проявление сомаклональной изменчивости по признаку чувствительности к алюминию отмечено при использовании сред с алюминием и без него. Так, выращенные в культуре клетки были успешно использованы при выведении устойчивого к кислым почвам сорго — культуры, весьма чувствительной к алюминию. Практикуется также культивирование каллуса чувствительных сортов сорго без наложения алюминиевого стресса. Регенерированные растения тестировали в полевых условиях на кислой почве с высоким содержанием обменного алюминия. Из 212 растений лишь у четырех обнаружили искомую устойчивость. Затем их подвергали самоопылению до поколения F5. На кислых почвах эти четыре линии демонстрировали преимущество над родительскими формами по силе роста, выживаемости, семенной продуктивности. Работа с ними была продолжена до поколения F7. В результате были получены растения с лучшей, чем у родительских форм, устойчивостью и с желательным фенотипом.

Сведения о природе мутаций будут также полезны при разработке стратегии устойчивости на всех уровнях организации растения. Устойчивые клеточные линии табака удалось отобрать путем выращивания непосредственно на кислой среде, содержащей алюминий, с последующим снятием его воздействия. Анализ данных по расщеплению на устойчивые и чувствительные особи в потомстве показал, что устойчивость обусловлена действием единственной доминантной мутации.

Стабильные по признаку устойчивости к алюминию линии моркови также были отобраны после 1—2 мес. выращивания культуры клеток непосредственно на среде, содержащей алюминий. В отдельном эксперименте линии моркови секретировали цитрат в среду при выращивании даже в присутствии выпавшего в осадок AlPO4, хотя и оставались чувствительными к ионным формам алюминия.

Таким образом, каждый из вышеперечисленных методов скрининга растений имеет свои преимущества и недостатки. Кроме того, не все методы одинаково эффективны при скрининге большого числа исходных образцов в селекционных программах. Использование же молекулярных маркеров, связанных с генами устойчивости к алюминию, позволяет перевести скрининг на генотипическую основу или на сочетание генотипа и фенотипа. Молекулярные маркеры также могут иметь преимущество при идентификации устойчивых форм растений у видов, механизм устойчивости у которых реализуется на разных этапах онтогенеза, что может быть сложно или вовсе невозможно выполнить, используя фенотипический скрининг.
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: