Физиолого-генетические основы повышения солеустойчивости
Низкая скорость поглощения Na+ и последующего его транспорта в побег является одной из основных детерминант солеустойчивости, так как генотипическая вариация скорости транспорта Cl- незначительна. Сорта мягкой пшеницы (гексаплоид, геном AABBDD) характеризуются низкой скоростью накопления Na+ и повышенной дискриминацией соотношения K+/Na+. Эти признаки, локализованные в длинном плече хромосомы 4D, контролируются одним локусом (Kna1) и связаны с молекулярным маркером, находящимся на верхней трети длинного плеча хромосомы 4D. Ген (гены), связанный с этим локусом, пока не идентифицирован. Сорта твердой пшеницы (тетраплоид, геном ААВВ) отличаются высокой скоростью накопления Na+, слабой дискриминацией K+/Na+, менее солеустойчивы (по сравнению с сортами мягкой пшеницы).
Повышения солеустойчивости твердой пшеницы можно достигнуть, создав новую зародышевую плазму с низкой скоростью накопления Na+ и сильной дискриминацией K+/Na+ путем гомологичной рекомбинации с хромосомой 4D. Однако это добавит нежелательный генотипический материал на транслоцируемый хромосомный сегмент, от которого потом будет трудно избавиться. Другой подход заключается в поиске естественного генетического разнообразия на геномах А или В.
Генотипические вариации в выведении Na+. Незначительное накопление Na+ (высокая дискриминация K+/Na+) обнаружено у местных сортов из подвидов Durum. На рис. 10.12 показан диапазон генотипической изменчивости в поглощении Na+ у рода Triticum, причем низкие значения примерно равны значениям, характерным для сортов мягкой пшеницы, а высокие значения типичны для современных сортов твердой пшеницы.
У большинства местных сортов накопление Na+ было таким же высоким и даже выше, чем у культурных сортов, и только у одного — очень низким. Введение этого признака в сорта твердых пшениц путем возвратных скрещиваний представляется перспективным при выведении солеустойчивых сортов твердых пшениц.
Наследование признака выведения Na+. Местный сорт с низким накоплением Na+ скрещивали с сортом твердой пшеницы Тамарой (Tamaroy), обладающим характерным для сортов твердых пшениц высоким накоплением Na+. При выращивании в условиях засоления (150 мМ NaCl) у особей F1 и F2 определяли в третьем листе концентрацию Na+ через 10 дней после появления всходов. Потомство F1 занимало промежуточное положение между родителями по накоплению Na+, а около 10% особей потомства F2 характеризовалось таким же низким содержанием Na+, как и соответствующий родитель. Это косвенно может указывать на вовлечение в детерминацию данного признака более одного (два-три) гена и его достаточно хорошее наследование. Высокий коэффициент наследуемости в узком смысле (0,79±0,07) свидетельствует о перспективности использования данного признака в селекционных программах.
Выведение Na+ и водный режим растения. Для проверки гипотезы о возможном ухудшении водного режима растения при выведении Na+ использовали четыре генотипа пшеницы с контрастными скоростями накопления Na+, выращиваемыми при засолении 150 мМ NaCl и в бессолевом варианте. Засоление не оказало заметного влияния на параметры водного режима — водный потенциал, тургор и оводненность тканей. Осмотическая адаптация происходила у всех генотипов, причем у генотипа с низким накоплением Na+ значительный вклад в осморегуляцию вносил K+, так как выведение Na+ из ткани сопровождалось поступлением дополнительного его количества. Определенную роль в осмотической адаптации играли органические кислоты и Cl-. Четырехнедельное солевое воздействие не оказало заметного влияния на генотипические различия, как по ростовым параметрам, так и показателям водного режима.
Методы отбора устойчивых форм. Одним из первых успехов селекции на солеустойчивость и затопление стала форма ячменя, дававшая урожай 11 ц/га зерна при выращивании в песке при поливе морской водой. Однако в поле этот успех закрепить не удалось. Более перспективным оказался опыт с 9 сортами пшеницы, 3 амфиплоидами пшеницы и Thinopyrum (рис. 10.13), выращиваемыми при сочетании засоления и затопления (WS) с дренированием и засолением (DS). Из этих данных было рассчитано соотношение WS/DS для массы побега и содержания Na+ в подфлаговом листе. Затопление оказывало наименьшее отрицательное влияние на рост растений с наибольшим выводом солей из растений. Более того, отдельное растение с наименьшим соотношением WS/DS для Na+ (оптимальное регулирование баланса ионов при затоплении) и хорошим ростом при затоплении было амфиплоидом пшеницы и Thinopyrum scirplum. Эти данные указывают на наличие у трав природных ценозов генов устойчивости к затоплению при засолении, которые теоретически могут быть интродуцированы в полевые культуры для успешного их выращивания при вторичном засолении почв. Однако пока преждевременно переносить приведенные выше данные лабораторных опытов непосредственно в поле.
В настоящее время существует несколько методов отбора растений на солеустойчивость, основанные на анализе параметров роста (урожайности), устойчивости к высоким концентрациям солей, а также физиологических механизмов.
Накопление вегетативной массы (урожайность). Отбор большого числа генотипов на солеустойчивость в полевых условиях представляет собой довольно сложную задачу из-за пространственной гетерогенности физических и химических свойств почвы, а также сезонных колебаний количества атмосферных осадков. Кроме солевого стресса на растения может действовать также засуха, затрудняя идентификацию именно солеустойчивых генотипов. На практике с этой целью используются контролируемые лабораторные условия. Именно таким образом было отобрано большинство солеустойчивых сортов мягких и твердых пшениц. В качестве основного критерия устойчивости использовали накопление большей биомассы при сильном засолении (до 250 мМ NaCl) в сравнении с контролем. Подобный подход, в частности, показал значительную генетическую вариабельность среди гекса- и тетраплоидных пшениц. Однако эффективность этой работы была невысока, так как корреляция между результатами лабораторных и полевых исследований отсутствовала. Возможно, применимость результатов лабораторных методов могла быть выше, если бы удалось найти большие генетические различия при среднем уровне засоления (50-100 мM NaCl).
Во многих исследованиях в качестве критерия устойчивости к средним условиям засоления используется скорость удлинения листьев или корней, однако до настоящего времени эти данные не были использованы в полевых условиях. Иногда в краткосрочных экспериментах обнаруживаются небольшие различия между генотипами, а в длительных — значительные отклонения по биомассе или урожайности. Так, при сравнении 20 генотипов пшеницы, ячменя и тритикале не было обнаружено существенных различий по скорости растяжения листовой пластинки ни у одного из сортов в течение первых 10 дней действия засоления, включая наиболее чувствительную твердую пшеницу и ячмень — самый солеустойчивый среди изученных генотипов. Такая же тенденция установлена и по накоплению биомассы (урожайности) у генотипов пшеницы при разных уровнях засоления. Поэтому длительные эксперименты с засолением (от 2 нед. до несколько месяцев) являются непременным условием выявления реальной солеустойчивости сортов сельскохозяйственных культур. Даже для риса, быстрорастущего и очень чувствительного к засолению вида, потребовались 3—4-недельные опыты для получения реальной, воспроизводимой в полевых условиях картины солеустойчивости. Ho длительные опыты, как правило, слишком затратны, поэтому до сих пор актуален поиск методик экспресс-диагностики солеустойчивости.
Устойчивость к высоким концентрациям солей. Эта группа методов, позволяющая работать с большим количеством образцов, включает прорастание или выживание растений при сильном засолении, оценку повреждения листьев по выходу электролитов и преждевременной потере хлорофилла, а также фотосинтетическо-го аппарата, оцениваемому по флюоресценции хлорофилла. По этим параметрам можно оценивать генотипы на устойчивость к засолению, но не к слабому или умеренному, характерному для большинства полей. Это может быть одной из причин того, почему генотипические различия по выживаемости и прорастанию редко воспроизводились в полевых условиях или длительных опытах. Главное при этом то, что неизвестна причина повреждения, которое может быть обусловлено водным стрессом, накоплением Na+ или Cl- в листьях, дефицитом K+ или Ca+. Кроме того, гибель листа может быть результатом ускоренного его старения из-за осмотического эффекта соли. Это может быть весьма актуальным в полевых условиях, когда засоленность возрастает при одновременном ухудшении водного режима почвы, что означает возросший осмотический стресс и ухудшение доступности почвенного азота и других питательных веществ для корня. Дефицит азота, в свою очередь, может вызвать ускоренное старение листьев в результате активной ремобилизации из них азота.
Отбор по физиологическим параметрам. Эти методы включают учет выведения Na+ из растения, дискриминации K+/Na+ и выведения Cl-. Они оказались достаточно эффективными при повышении солеустойчивости твердых (тетраплоидных) пшениц, менее устойчивых, чем мягкие (гексаплоидные) пшеницы. Что касается выведения Na+ из растения, низкая концентрация Na+ в листовой пластинке хорошо коррелирует с соле-устойчивостью, в то время как концентрация K+ или соотношение K+/Na+ коррелирует слабо. Эти показатели не зависят от условий корнеобитаемой среды и уровня освещенности, т. е. факторов, определяющих интенсивность транспирации. Более того, скорость накопления биомассы не оказывает влияния на концентрацию Na+ в листьях или дискриминацию K+/Na+, что указывает на раздельный контроль ионного транспорта и скорости роста побега. Однако подобная тенденция отмечена не для всех видов. В частности у риса установлена зависимость содержания Na+ от скорости роста побега.
Следует заметить, что при умеренном засолении у сортов пшениц местной (народной) селекции с низкой концентрацией Na+ урожайность, как правило, выше, чем у генотипов с высоким содержанием Na+. Поэтому способность генотипов выводить Na+ из растения может быть полезным критерием для отбора солеустойчивых генотипов в поле. Тем более, что этот параметр хорошо наследуется, и идентифицирован его молекулярный маркер.
В качестве критерия устойчивости к высокой концентрации Na+ в тканях служит отсутствие повреждения листьев. Концентрации Na+ свыше 100 мМ ингибируют большинство ферментов, так что при содержании Na+ в ткани выше 100 мМ, что соответствует 0,5 мМ Na+/г сухой массы (при содержании воды 5 г/г сухой массы), должна происходить эффективная компартментация Na+ в вакуолях. Этот механизм функционирует у галофитов, переносящих концентрации Na+ намного выше 100 мМ, не имея метаболической адаптации к высокому засолению. Действительно, активности ферментов in vitro у гликофитов (например, кормовых бобов и гороха) одинаково чувствительны к засолению. В то же время у гликофитов концентрации Na+ до 1 мМ/г сухой массы безопасны для фотосинтезирующих тканей у многих видов. Так, у тетраплоидных пшениц содержание Na+ становится потенциально токсичным при концентрациях свыше 1,25 мМ/г сухой массы, что равнозначно 250 мМ Na+ в водной фракции листа. Выше этой концентрации начинается внеустьичное ингибирование фотосинтеза у твердой пшеницы.
Что касается повреждения листьев, то оно может быть обусловлено целым рядом причин. Во-первых, осмотический эффект соли в почвенном растворе может вызвать ускоренное старение листьев из-за дефицита в них воды или гормональных эффектов, исходящих от корней. Во-вторых, возможен дефицит одних или избыток других ионов. В-третьих, может наблюдаться токсический эффект солей в листьях из-за их высокой концентрации в цитоплазме и клеточной стенке. Только последняя причина имеет отношение к компартментации Na+ и соответственно к устойчивости ткани.
Отбор на незначительные внутривидовые различия. Различия по солеустойчивости между близкородственными видами очень трудно выразить количественно, так как снижение ростовых параметров сильно зависит от продолжительности солевого воздействия на растения. Засоление снижает водный потенциал корней, быстро подавляя рост на фоне сопряженного изменения целого ряда параметров метаболизма, идентичных тем, что вызываются водным стрессом. Позже подключаются солеспецифические эффекты, оказывающие влияние на рост и морфогенез.
Первые несколько дней или недель засоления могут не обнаружить различий по ростовым реакциям даже между видами (сортами), сильно различающимися по солеустойчивости, например сортами твердой (слабосолеустойчивой) пшеницы в сравнении с гораздо более солеустойчивыми сортами мягкой пшеницы и особенно ячменя. Это объясняется двухфазностью реакции роста на засоление. Первую фазу — торможение роста можно заметить достаточно быстро, она обусловлена присутствием солей в корнеобитаемой зоне. Ее можно назвать фазой водного стресса, или осмотической, и в ней, как правило, встречаются слабые генотипические различия. Вторая фаза — торможение роста наступает гораздо позже и связана с ускоренным старением листьев. Последнее обусловлено, видимо, внутренними повреждениями из-за накопления до токсичного уровня солей в транспирирующих листьях, что приводит к преждевременному старению листьев и, соответственно, снижению ИФ растения до уровня, не обеспечивающего формирование новых листьев и рост вегетативной массы. Причина повреждения может заключаться в неспособности клеток компарт-ментировать избыточное количество солей в вакуолях. В результате соли быстро концентрируются в цитоплазме, ингибируют активность ферментов или же накапливаются в клеточной стенке. Доказательства аккумулирования ионов в апопласте до весьма высоких концентраций получены, в частности, на листьях риса, но не кукурузы.
Двухфазная реакция роста на засоление убедительно показана для пшеницы и кукурузы. Два гибрида кукурузы с 2-кратной разницей по скорости накопления Na+ в листьях обнаружили одинаковое снижение ростовых параметров через 15 дней выращивания при 80 мМ NaCl. Два других гибрида, также характеризующиеся двукратной разницей по накоплению Na+, не отличались по особенностям ингибирования роста при выращивании в течение первых 4 нед. в условиях засоления (100 мМ NaCl), но заметно различались через 8 нед. Аналогичная тенденция установлена и для генотипов пшеницы, контрастных по солеустойчивости, причем когда число погибших листьев превысило 20% от общего их числа на растении, рост растения замедлился, и многие особи начали отмирать.
Эти наблюдения указывают на то, что первоначальное снижение скорости роста при засолении обусловлено осмотическим эффектом солей в корнеобитаемой среде. Неустойчивые генотипы от устойчивых отличает неспособность предотвратить накопление солей до токсичного уровня в транспирирующих листьях при последующем росте в условиях засоления.
Интервал времени, необходимый для обнаружения генотипических различий по скорости роста, зависит от степени засоления и солеустойчивости вида. Вторая фаза наступает раньше у растений, плохо выводящих Na+, таких, как люпин или кормовые бобы, а также при повышении засоленность и температуры корнеобитаемой среды. Например, для риса, выращиваемого при высоких температурах, 10—15 дней засоления достаточно, чтобы обнаружить генотипические различия по накоплению биомассы, коррелирующие с разницей по урожайности. Однако длительные эксперименты непрактичны для скрининга большого числа генотипов или отбора солеустойчивого потомства.
Всхожесть является удобным тестом для массового отбора солеустойчивых генотипов. Однако корреляция между ней и ростовыми параметрами при последующем длительном выращивании при засолении достаточно слабая, что хорошо показано на ячмене, твердой и мягкой пшенице, люцерне и других культурах. Это объясняется тем, что процессы, управляющие растяжением клеток при прорастании и при последующем росте, совершенно разные. Поглощение воды семенем и его набухание представляют собой чисто физико-химические процессы в отличие от биохимических процессов, контролирующих деление клеток и их растяжение в период последующего роста. Многие виды, такие, как пшеница и ячмень, способны прорастать при очень высоких концентрациях NaCl (до 300 мМ и более), однако последующий рост проростков в этих условиях уже невозможен. Именно физико-химическая природа набухания объясняет, почему существуют незначительные межвидовые различия по всхожести семян при засолении. Например, галофиты не превосходят гликофиты по всхожести при засолении, но существенно опережают их по скорости удлинения гипокотиля.
Отбор генотипов непосредственно при прорастании на сильно засоленном фоне не имеет глубокого практического смысла, так как в поле при посеве концентрация почвенного раствора выше 200 мМ Na+ встречается достаточно редко.
Выживаемость при сильном засолении также представляет собой удобный тест, однако он больше подходит для многолетников, чем однолетников. В любом случае отбор видов по выживаемости в условиях сильного засоления, а не по ростовым параметрам, несет в себе риск отбора на пониженную продуктивность. Кроме того, уровни засоления даже в пределах одного поля сильно различаются, и большая часть урожая получается с самых слабозасоленных участков. Поэтому отбор генотипов по их поведению только в условиях сильного засоления может быть неэффективным.
Повреждение листьев можно оценить разными методами, начиная от выхода электролитов из листовых высечек до флюоресценции хлорофилла. Параметры флюоресценции Fv/Fm у предадаптированных в темноте листьев не оказались более чувствительными к засолению, чем само содержание хлорофилла: оба показателя начали уменьшаться одновременно.
Культура тканей оказалась малоэффективной для отбора солеустойчивых генотипов. Вероятно, это обусловлено тем, что солеустойчивость является продуктом действия не единичной клетки, а результатом структурной и функциональной интеграции на уровне целого растения.
Устьичная проводимость для молекул воды может быть перспективным методом для экспресс-оценки реакции листа на солевой стресс. Пониженная устьичная проводимость листа в ответ на засоление обусловлена осмотическим стрессом, инициированным исходящими от корня сигналами, поскольку он наблюдался до начала интенсивного концентрирования NaCl в листе до высокого уровня. Определение проводимости осуществляется быстро и легко с помощью порометра, что важно для скрининга большого числа образцов. Что касается измерения интенсивности газообмена или даже флюоресценции хлорофилла, они вряд ли могут быть использованы для отбора. Скорее всего их можно будет использовать для изучения небольшого числа генотипов, предварительно отобранных с помощью более быстрого метода. Методы массового отбора обобщены в таблице 10.4.
Прорыва в понимании механизмов солеустойчивости в будущем можно ожидать, изучив процессы, контролирующие транспорт Na+ и Cl- в системе целого растения.
Молекулярные маркеры физиологических признаков, связанных с солеустойчивостью. Быстрые и специфические методы необходимы для скрининга больших коллекций материнской плазмы, разработки молекулярных маркеров, обнаружения генов солеустойчивости и пирамидирования признаков и генов. При использовании этих методов не возникнет необходимости выращивать растения в контролируемых условиях, так как они позволяют избежать плейотропных эффектов или воздействия других переменных, таких, как генетически детерминированные различия в скорости роста, морфологии или фенологии.
Молекулярные маркеры могут снизить объем работ, связанных с фенотипическими скринами. Если идентифицирован ген или локус, связанный со специфическим признаком, могут быть разработаны молекулярные маркеры. Последние могут быть проверены на семенах или проростках, что позволит создать экономичный способ скрининга большого числа особей в популяции. Использование молекулярных маркеров не связано с нарушением целостности объекта и не требует контроля или вариантов с засолением. Однако для обнаружения маркеров необходим специфический фенотип, а его можно разработать на основе методов селекции, использующих физиологические признаки.
Для обнаружения генов с использованием микрочипов специфические фоны будут более полезны, чем просто устойчивость к засолению, т. е. сравнение роста в контрольном и опытном (засоленном) вариантах. Эти фоны покажут, обусловлена ли данная функция гена-кандидата осмотической, или солеспецифической, адаптацией к засолению. Даже в генной инженерии использование специфического генотипа будет полезным для проверки функций трансгена в различной генетической предыстории и пирамидирования различных генов или признаков.
Использование молекулярных маркеров значительно повышает эффективность селекционных программ. Однако разработка маркеров, надежных в широком диапазоне условий выращивания, может представлять достаточно сложную задачу и полностью зависит от аккуратного отбора по фенотипу. Понимание физиологии поглощения Na+ является определяющим в разработке надежного и точного фенотипического теста и соответственно идентификации молекулярных маркеров и локусов количественных признаков (QTL).
QTL на солеустойчивость описан для нескольких видов, включая рис, ячмень и мягкую пшеницу. Однако эти исследования не привели к разработке маркеров, которые могут быть использованы при широком разнообразии зародышевой плазмы и всех возможных взаимодействиях между физиологическими признаками и маркером. Одна из причин этого — ограниченное генетическое разнообразие современных сортов и использование близкородственных родительских линий. Поэтому в современных исследованиях используются достаточно контрастные формы. Так, для разработки маркера по солеустойчивости у мягкой пшеницы (AABBDD) использовали эгилопс (Ae. tauschii), являющийся диплоидным потомством мягкой пшеницы (DD). Этот вид (синоним Ae. squarrosa, Triticum tauschii) выбрали потому, что геном D ответственен за ускоренное выведение Na+ у мягкой пшеницы (в отличие от твердой). После проработки большой коллекции Ae. tauschii обнаружили особи с высоким и низким содержанием Na+ в только что завершившем рост пятом листе и скрестили их. Потомство F1 выращивали при разном засолении. В результате получили особи с меньшей концентрацией Na+ в искомом листе, чем у родительских форм. Это указывает на то, что признак выведения Na+ из растения контролируется многими генами. Коэффициент наследуемости этого признака в узком смысле составил 0,11, свидетельствуя или о недостаточно точном фенотипе, или о сильном взаимодействии генотипа и окружающей среды. Прояснить ситуацию могут опыты в разнообразных погодных условиях.
Интересные результаты получаются при скрещивании особей Ae. tauschii с разной концентрацией Na+ в листьях и различной солеустойчивостью с обычной тетраплоидной пшеницей с целью выведения синтетической гексаплоидной пшеницы. Солеустойчивость последней была выше, чем у тетраплоидных родителей прежде всего благодаря поддержанию массы зерен. Синтетические гексаплоиды варьировали по солеустойчивости из-за разной солеустойчивости Ae. tauschii, использованной при скрещивании. Это указывает на то, что гены солеустойчивости диплоидов экспрессируются на гексаплоидном уровне.
Особенно интересно картирование генов у твердой пшеницы (AABB) и последующая разработка молекулярных маркеров, отвечающих за выведение Na+. У твердой пшеницы отсутствует геном D, определяющий выведение Na+ из растения. Поэтому предпринимаются попытки обнаружить источник этого признака в геноме А или В, в старых местных сортах твердой пшеницы, родственных тетраплоидных видах и перенести этот признак в сорта твердой пшеницы.