Изучение генетики и физиологии использования азота с помощью QTL

QTL поглощения и эффективности использования азота. Подробно он изучен на кукурузе. Больше QTL урожая и его структуры обнаружено у растений кукурузы на высоком, нежели на низком фоне азота. Однако в последнем случае обнаружено больше QTL, связанных с содержанием азота в растении. По поглощению азота в расчете на одно растение на высоком фоне азота выявлено пять QTL: три на хромосоме 1 и два на хромосоме 4. Вместе с тем только один QTL обнаружен при дефиците N, что обусловлено очень низкой генотипической вариацией из-за эффекта разбавления (высокая отрицательная корреляция между накоплением сухой массы и концентрацией азота в ней). В отличие от поглощения N пять QTL эффективности использования азота (ЭИА) при его дефиците определяли 39% фенотипической вариации, в то время как на высоком фоне N обнаружен лишь один QTL. Подобные данные указывают на дифференциальную регуляцию генов при разном азотном режиме.

При дефиците N обнаружен лишь один QTL, связаный с ремобилизацией N из стебля. Он находится на хромосоме 1, совпадая с геном glnl, кодирующим цитозольную глутаминсинтетазу (ГС). Вместе с тем на высоком фоне азота выявлены 10 QTL, причем пять из них находятся на хромосоме 1. Первые три связаны с ремобилизацией азота (в абсолютном и относительном выражении) из целого растения, из листовых пластинок или из стебля в фазе цветения. Еще один QTL на хромосоме 2 также связан с процессами ремобилизации азота, он совпадает с QTL зерновой продуктивности на высоком агрофоне. На хромосоме 4 было обнаружено три QTL, два из которых связаны с ремобилизацией азота: первый совпадал с QTL массы единичной зерновки, обнаруженным при дефиците азота, а второй — с QTL массы единичной зерновки в обоих вариантах выращивания. Более того, этот второй QTL совпадал с двумя генами азотного метаболизма (НР2 и gln 1).

Таким образом, из 10 QTL реутилизации азота три совпадали с QTL массы единичной зерновки и один — с QTL зерновой продуктивности. Эти данные подчеркивают важную роль реутилизации азота во время налива зерновки, несмотря на отсутствие корреляции между этим показателем и урожаем зерна или массой единичной зерновки. Принимая во внимание важную роль поглощения азота после цветения в наливе зерна на высоком фоне азота, ожидалось гораздо большее число QTL поглощения азота, однако они не были выявлены. Это может быть обусловлено вовлечением в данный процесс большого числа генов с относительно малым эффектом каждого из них.

QTL содержания нитратов и активности HP в листьях. Было выявлено пять QTL содержания нитратов в листьях, детерминирующих 28% фенотипической вариации, причем два из них находились на хромосоме 2 и три — на хромосоме 5. Один QTL содержания нитратов на хромосоме 2 положительно совпадал с QTL массы единичной зерновки на высоком фоне азота. Один из подобных QTL на хромосоме 5 также положительно совпадал с QTL зерновой продуктивности растения и массы единичной зерновки независимо от условий азотного питания. Эти результаты согласуются с положительной корреляцией между концентрацией нитратов в листьях проростков, с одной стороны, и зерновой продуктивностью и массой единичной зерновки растений независимо от уровня азотного питания — с другой. Таким образом, концентрация нитратов в проростках может быть индикатором способности растений поглощать азот после цветения.

Два главных QTL активности НАДН*HP в листьях были обнаружены на хромосоме 5 и определяли на 36% наблюдаемую фенотипическую вариацию, что для двух QTL, несомненно, весьма высокое значение. Один из локусов НАДН*HP располагался в зоне локуса gln4 и отрицательно совпадал с QTL содержания нитратов и зерновой продуктивности при обоих вариантах выращивания.

QTL активности ГC. Выявлено шесть QTL активности ГС в листьях, объясняющих 52,5% фенотипической вариации: три — на хромосоме 1, два — на хромосоме 5, один — на хромосоме 9. Интересно, что три из этих шести совпадали с генами, кодирующими цитозольную ГС, и обозначены как gln1, gln2 и gln4. Видимо, для этих трех генов активность цитозольной ГС в листьях регулируется главным образом на уровне транскрипции.

Два QTL активности ГС совпадали с QTL урожайности и ее компонентов (числа зерен и массы единичной зерновки). К этому следует добавить положительную корреляцию между зерновой продуктивностью и активностью ГС при дефиците азота. Однако QTL зерновой продуктивности на хромосоме 5 характерны для обоих уровней азотного питания, поскольку благоприятный аллель обнаружен в обоих вариантах. Вместе с тем QTL зерновой продуктивности, совпадающий с активностью ГС в листьях, на хромосоме 1 выявлен только при дефиците азота. Это может означать, что продукты трансляции генов gln2 и gln4 могут играть разную роль. Аналогичным образом QTL реутилизации азота в зоне локуса gln1 (на хромосоме 1), который позитивно совпадает с QTL активности ГС, можно рассматривать как QTL истинной реутилизации азота, a QTL реутилизации в зоне локуса gln2, который негативно совпадает с QTL активности ГС, можно рассматривать как QTL поглощения азота в период после цветения. Видимо, различные гены ГС выполняют разнообразные неперекрывающиеся функции в зависимости от органов, фазы развития и уровня азотного питания.

Совпадение локуса gln4 и нескольких QTL зерновой продуктивности, массы единичной зерновки, активности ГС в листьях, активности HP и содержания нитратов в листьях указывает на то, что доступность нитратов и реакции, катализируемые HP и ГС, могут быть ключевыми в детерминации ЭИА на формирование зерна. Однако существуют сложные взаимосвязи между активностями ГС и HP, что согласуется с негативным эффектом нитратвос-станавливающей активности растения на урожай и его компоненты.

Следует также подчеркнуть, что на хромосоме 10 замечено совпадение локуса ГС (gln5) и QTL продолжительности периода между цветением початка и выметыванием метелки. Этот локус связан с пластидной ГС. Известно, что разные гены, кодирующие ГС, характеризуются дифференциальной экспрессией в зависимости от физиологического статуса и фазы развития растения.

Энзимы играют важную роль в регуляции роста и продуктивности растений при различных уровнях азотного питания. На растениях кукурузы с внедренными генами-мутаторами была изучена роль двух энзимов — продуктов генов Gln1-3 и Gln1-4. У мутантных линий кукурузы gln1-4 происходило уменьшение размера зерен, а у линии gln1-3 — уменьшение их числа. При изучении кумулятивного эффекта обеих мутаций было обнаружено, что у трансгенных растений со сверхэкспрессией гена Gln1-3 в листьях увеличивалось число зерен. Видимо, изоэнзим гена Gln1-3 играет важную роль в генетическом контроле зерновой продуктивности на высоком агрофоне. В условиях недостаточного азотного питания снижение числа зерен у мутантных растений по сравнению с диким типом было меньшим. У мутантных растений при выращивании на низком уровне азотного питания (-N) формирование зерен не происходило, а у линий со сверхэкспрессированием гена ГС при тех же условиях формировалось большее количество зерен (рис. 9.15), но не наблюдалось увеличения продуктивности по сравнению с нулевыми сегрегантами на высоком агрофоне (+N). Это дает основание предполагать, что у кукурузы ГС контролирует зерновую продуктивность независимо от уровня азотного питания.

Проведенный выше анализ показывает, что генетическая вариабельность экспрессировалась по-разному при отличающихся режимах азотного питания и, соответственно, зерновой продуктивности (разница составляет 38%). Возможно, при дефиците азота экспрессия вариабельности контролируется специфичными генами, детерминирующими реутилизацию азота, в то время как на высоком фоне азота — генами, определяющими поглощение азота в постфлоральный период.

Проводятся эксперименты с целью сверхэкспрессировать ген gln4, кодирующий цитозольную ГС, и перенести желательный аллель в генотип с неблагоприятным аллелем с тем, чтобы проверить, улучшатся ли налив зерна и зерновая продуктивность. Другими генами-кандидатами кроме gln4 являются gln1, gln2 и gln3, которые детерминируют активность ферментов, участвующих в реутилизации азота в процессе налива зерна. Однако остается определить, контролируются ли процессы ассимиляции азота с участием ГС одним или несколькими генами.

Известно, что значительное число генов, экспрессируемых в условиях стресса, в том числе и минерального, конститутивны, но в неблагоприятных условиях могут регулироваться различным образом. У кукурузы эффект некоторых генов, отвечающих за формирование урожая в целом и его компонентов в частности, может также проявляться различно в зависимости от адаптации растения к уровню азотного питания. Поэтому необходимо установить, какие именно энзимы и регуляторные белки важны для формирования урожая на низком агрофоне, а также идентифицировать соответствующие гены и их локусы. Однако у растений на низком агрофоне эпистатическое взаимодействие генов и наличие несвязанных генов из различных генотипов могут осложнить идентификацию генов и их клонирование. Необходимо также учитывать, что большинство современных линий и сортов выведены для выращивания на высоком агрофоне, в связи с чем необходимо разработать специальные селекционные программы, включающие родительские линии и популяции, адаптированные к различным условиям окружающей среды (климат, фотопериод, влагообеспеченность и т. д.).