Анализ реакции растений на нитраты с помощью технологии микрочипов

К концу прошлого века было известно об индуцировании NO3- около дюжины генов, участвующих в ассимиляции нитратов и аммония, энергетическом метаболизме, переключении с синтеза крахмала на образование органических кислот. Были также идентифицированы гены HP (NiA1 и NiA2), НиР и ген переносчика нитратов NRT1.1. Гены, идентифицированные позднее, были классифицированы в две группы - метаболические и регуляторные. В последующих экспериментах число «откликающихся» на NO3- генов в корнях возросло до 1200, причем 555 индуцировалось, а 621 репрессировалось. Интересно, что число подобных генов в стеблях — лишь 183. В число индуцируемых и репрессируемых входили гены, вовлеченные в гликолиз, метаболизм трекаллозы-6-фосфата, транспорт и метаболизм железа, поглощение и восстановление сульфатов. Влияние NO3- на гены первых двух процессов было неожиданным. Видимо, активация генов гликолиза поддерживает пентозофосфатный путь и высвобождение энергии. Кроме того, не все гены из семейства реагировали на нитраты. Так, среди NRT2-транспортеров нитратов 2.1, 2.2, 2.4 не индуцировались, а 2.3, 2.6, 2.7 не обнаружили никакой реакции. Интересно, что на дефицит азота в среде сильнее реагировали корни, а не побеги.

Интересным объектом для изучения данной проблемы являются так называемые нулевые мутанты по ИР, которые не обнаруживают активность HP и не растут в среде, содержащей в качестве единственного источника азота NO3. Эти мутанты выращивались на сукцинате аммония, затем их на 2 ч переносили в нитрат (5 мМ); РНК в корнях и стеблях анализировали с помощью ATH1-чипов. У дикого типа на эту процедуру среагировали 1596 генов в корнях и побегах, в нулевом мутанте индуцировались или репрессировались 595 генов. Это позволило выявить набор генов, которые могут быть идентифицированы как реагирующие непосредственно на нитраты, так как этот отклик не требует восстановления NO3-. Экспрессия этих генов прежде всего в категориях: энергия, общий и ассимиляционный метаболизм и гликолиз, метаболизм N и S, транспорт, предполагает, что эти процессы находятся под сильным влиянием NO3-.

Однако отмеченные гены принадлежат лишь к одному из трех классов генов, обнаруженных как у дикого типа, так и у мутантов. Гены второго класса реагировали у дикого типа, но не у мутантов. Этот класс включает гены, отвечающие за отдельные продукты превращения нитратов, поскольку для их индуцирования/репрессии необходимо восстановление NO3. Однако поскольку нулевой мутант по HP представляет собой гибрид двух экотипов Коламбия (Columbia) и Ландсберг (Landsberg), любые реакции на NO3- могут быть обусловлены полиморфизмом между двумя экотипами, но не мутацией по HP. Третий класс генов реагировал лишь у нулевых мутантов по HP, однако значение этих генов пока не определено.

Органы реагировали неодинаково на уровень азотного питания. Общее число реагирующих на высокий уровень нитратного питания генов в корнях (979) через 20 мин действия фактора не сильно отличалось от такового на низкий нитратный фон (1176). Таким образом, количественно регуляция корней, видимо, насыщается уже к 20-й минуте, поскольку более высокая концентрация NO3- и длительная экспозиция (2 ч) не увеличивают число реагирующих генов. Вместе с тем у побегов число искомых генов увеличивается со 183 при низких концентрациях NO3- и 20-минутной экспозиции до 897 при высоких концентрациях и 2-часовой экспозиции. Следовательно, побеги реагируют примерно в той же мере, что и корни, но более медленно. Самое интересное в этих данных то, что большинство реагирующих генов в корнях и побегах не совпадали, что указывает на органоспецифичность реакций на условия азотного питания.

Одним из наиболее интересных генов, реагирующих непосредственно на NO3-, является изопентинилтрансфераза3 (iPT3). Этот белок катализирует первую и ключевую реакцию биосинтеза цитокинина. Промотор этого фермента экспрессируется во флоэме и индуцируется нитратами. Ген iPT3 гораздо сильнее индуцируется в корнях (в 23 и в 7 раз у дикого типа и мутанта соответственно), чем в побегах (примерно в 2 раза). Возможно, этот ген отвечает за стимулируемый нитратом биосинтез цитокинина, что обнаружено на арабидопсисе.

Исключение NO3- из питательного раствора приводило к уменьшению мРНК генов, вовлеченных в фотосинтез, синтез хлорофилла и пластидных белков и к повышению мРНК многих генов вторичного метаболизма. Содержание глутамина и глутамата при этом было заметно ниже (в 50 и 6 раз соответственно), а оксиглутарата, напротив, в 2—3 раза выше. Внесение NO3- в питательный раствор приводило к резкому увеличению (через 30 мин) числа генов, вовлеченных в поглощение и метаболизм нитратов, а также в образование восстановителей и органических кислот, хотя уровень первичных метаболитов заметно не повышался. Более длительная экспозиция (3 ч) приводила к индукции генов, вовлеченных в синтез аминокислот и нуклеотидов, синтез и процессинг РНК, синтез белков. Трехчасовая экспозиция увеличила число реагирующих на NO3- генов в 2—2,5 раза (1292 и 645 генов соответственно через 3 ч 30 мин). Технология микрочипов позволила выявить 345 генов, которые представлены чаще всего в детерминации таких процессов, как ассимиляция нитратов, фосфорилирование, гликолиз, глюконеогенез, общий и углеводный метаболизм, пентозофосфатный цикл, метаболизм азота, серы и аминокислот, ассимиляция аммония. В целом нитраты сильнее влияют на гены синтеза белка и рибосомальных структур.

Применение транскриптомной технологии и биоинформатики дало возможность получить обобщенную картину реакции проростков арабидопсиса на нитраты. На сегодня известны практически все гены, обнаруживаемые с использованием технологии микрочипов в разных условиях азотного питания. Также известно, какие гены реагируют непосредственно на нитраты, а какие — на другие факторы, как реакция на нитраты определяется углеводным статусом растения. Остается идентифицировать регуляторные гены, являющиеся посредниками в реакции на нитраты и интегрировать реакцию на NO3- в общую сигнальную сеть растения.