Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Генетический контроль морозоустойчивости растений

10.11.2018

Гены, которые экспрессировались в ответ на низкую температуру — cor-гены, были открыты в конце прошлого столетия. Это семейство генов кодирует COR-белки, имеющие свойства высокой гидрофильности и термоустойчивости, но не обладающие ферментативными свойствами. Полагают, что COR-белки важны для формирования морозостойкости, поскольку связаны с предотвращением перехода мембран из ламеллярной в гексагональную структуру, что обычно происходит при обезвоживании мембран более чем на 50%. Трансформированные генами соr14, соr15, соr6 растения арабидопсиса повышали морозостойкость, но не более, чем на 2—3 °C. Наибольшее повышение морозостойкости достигалось при длительном действии пониженной температуры, которая индуцировала все гены белков холодового шока. Это указывает на возможное существование других генов, которые экспрессируются под действием пониженной температуры и регулируются не только ее краткосрочным, но и длительным действием. Одновременно подавляется экспрессия других генов, связанных с активной вегетацией.

Несмотря на множество исследований, до сих пор нет единой точки зрения о специфике действия генов, контролирующих этот признак. Сообщалось о разных типах наследования искомой устойчивости: рецессивном, аддитивном, доминантном и сверхдоминантном. Подобная разноречивость данных генетических исследований объясняется, по меньшей мере частично, слабой корреляцией устойчивости, определенной в полевых и лабораторных условиях.

Устойчивость зерновых культур к низким отрицательным температурам определяется эффективным взаимодействием структурных и регуляторных генов. Переход от вегетативной к генеративной фазе развития является критическим и сопровождается репрессией генов, индуцирующихся низкотемпературным воздействием. В результате полная экспрессия генов морозоустойчивости происходит только в фазе вегетативного развития. Растения в фазе генеративного развития обладают ограниченным потенциалом холодовой адаптации.

Идентификация QTL-локусов и генов-кандидатов морозоустойчивости. У озимых зерновых устойчивость к низким температурам и морозу достигается благодаря холодовой акклимации, происходящей одновременно с яровизацией. При этом пик устойчивости достигается при завершении яровизации и, как правило, на коротком дне. Локус морозоустойчивости Fr (от англ. Frost resistant) у пшеницы был идентифицирован на 5-й хромосомной группе в непосредственной близости к локусам яровизации vrn-A1, vrn-B1 и vrn-D{. На хромосоме 5Am диплоида Т. топососсит два локуса Fr-A1 и Fr-A2 участвуют в индуцированной холодом экспрессии генов, связанных с морозоустойчивостью. Локус Fr-Am2 несет кластер генов CBF, кодирующих транскрипционные факторы с ключевой ролью в активации низкотемпературных стресс-реакций у растений. У гексаплоидной пшеницы экспрессия определенных генов CBF, локализованных в Fr-A2 регионе, также коррелирует с повышенной толерантностью к низким температурам.

Какие же геномные регионы, кроме vrn1, ассоциированного с типом развития растений (озимый/яровой), связаны с морозостойкостью? Для ответа на этот вопрос был проведен опыт с сортами и изогенными линиями пшеницы, различающимися по LT50. При этом озимый сорт Норстар характеризовался максимальной морозоустойчивостью, а яровой сорт Монитоу — минимальной, о чем свидетельствуют значения LT50 (табл. 5.1).

Две реципрокные почти изогенные линии — Винтер Монитоу и Спринг Стар — были получены в результате бэккроссирования Норстар х Монитоу. Винтер Монитоу содержит генетические характеристики Монитоу, но несет аллель озимости от сорта Норстар, в то время как у Спринг Норстар экспрессируется признак яровости Монитоу в генетических характеристиках Норстар.

Предполагаемые QTL-локусы морозоустойчивости локализованы на хромосомах 1D, 2А, 2В, 5А, 6D и 7В. Однако в настоящий момент только QTL на хромосомах 1D и 5А были подтверждены картированием. Интересно, что главный локус морозоустойчивости, идентифицированный на хромосоме 5А, совпал с позицией локуса морозоустойчивости Fr-A2, картированного близко к vrn-A1 у диплоидной пшеницы.

Важно отметить, что QTL-локусы на хромосоме 5А ассоциированы с двумя генами CBF, отличающимися сильной идентичностью последовательностей Cbf14 и Cbf15 и картированными в локусе Fr-2 у Т. топососсит. Как Cbf14, так и Cbf15 весьма активны в тканях сорта Норстар в период xолодовой акклимации (закалки) и соответственно могут рассматриваться как гены-кандидаты, ответственные за межсортовые различия по холодоустойчивости у озимой пшеницы.

QTL-локусы на хромосоме 5А определяли 40% вариации холодоустойчивости, а наличие этого региона у 42% дигаплоидных линий пшеницы коррелировало с высокой морозоустойчивостью (LT50 < -18 °C). Однако поскольку 8% линий с QTL-локусами на хромосоме 5А все же имеют показатели LT50, аналогичные неустойчивому родителю, участвующему в скрещивании, этот участок хромосомы может зависеть от других регионов в геноме. Эти регионы могут кодировать индукторы генов CBF, не контролируемые последними, но необходимые для проявления морозоустойчивости. Так, например, у арабидопсиса 28% индуцируемых низкими температурами генов активируются независимо от CBF.

Для идентификации возможных генов-кандидатов морозоустойчивости в пределах кластера FR2-CBF использовалось профилирование транскриптов. Большинство генов, изученных в этом локусе, индуцировалось при действии температуры 2 °C в течение 2 ч, причем гены TaCBF14 и 15 проявили самый высокий уровень среди других транскриптов. Ho важнее то, что уровни транскриптов TaCBF14, 15 и 16 были в 4 раза выше у линий с высокой морозоустойчивостью, чем у линий чувствительных к морозу. Аналогичная тенденция отмечена на ячмене, но при этом CBF-гены (HvCBF2 и HvCBF4) отличались от обнаруженных на пшенице. Эти данные указывают на то, что хотя различные сочетания генов CBF могут детерминировать морозоустойчивость, увеличение уровня транскриптов CBF часто коррелирует с повышением морозоустойчивости. У линий Т. mоnоcoccum с рекомбинантными изменениями в локусе FR2 главные различия в морозоустойчивости и в дифференциальной регуляции генов COR14b и WCS120 были картированы на центральном участке кластера генов CBF, полностью связанном с TmCBF12, TmCBF14 и TmCBF15. Меньший эффект на морозоустойчивость оказывает ген TmCBF16. Этот набор генов CBF частично совпадает с обнаруженными у полиплоидной пшеницы.

Связь между генами Cbf и морозоустойчивостью. Семейство генов Cbf играет ведущую роль в регуляции холодового стресса у растений. Оно широко распространено среди зерновых культур. Так, у риса оно насчитывает 5 членов, у Т. monococcum — по меньшей мере 13, а у ячменя — 17. Экспрессия транскриптов Cbf ап-регулируется (активизируется) через 15 мин xолодовой экспозиции арабидопсиса. Быстрое снижение температуры с 20 до 4 °C приводит к ускоренному накоплению транскиптов Cbf с максимумом через 3 ч экспозиции. Затем происходит резкое падение мРНК и через 9—21 ч холодового стресса наблюдается лишь очень низкий уровень мРНК Cbf. Аналогичный профиль экспрессии отмечен также после постепенного понижения температуры. Следовательно, xолодовой шок не обязателен для индукции экспрессии Cbf.

Индуцированное xолодовым воздействием транзиетное накопление Cbf-подобных транскриптов генов Cbf арабидопсиса отмечено у пшеницы и ржи. Ген Cbf3 был впервые картирован на хромосоме 5H у ячменя и затем на хромосоме 5Am у однозерной пшеницы Т. топососсит (2n = 14), связанной с локусом морозоустойчивости Fr-Am2. Тот же регион на хромосоме 5В влияет на морозоустойчивость гексаплоидной пшеницы Т. aestivum (2n = 42), а на хромосоме 5Н — на морозоустойчивость ячменя. Локус, включающий гены HvCbf 3, HvCbf 4 и HvCbf 8 у ячменя был обозначен как Fr-H2. Однако не все гены Cbf ячменя индуцируются при холодовом воздействии. Так, ген HvCbf2 экспрессируется конститутивно, тогда как лишь несколько конформационных изменений, индуцированных холодом, могут его активировать. У мягкой пшеницы два региона на длинном плече хромосомы 5А, а именно Rcg1 и Rcg2 вовлечены в регуляцию холодо-индуцируемого гена cor 14b. Rcg1 соответствует локусу Fr-Am2, картированному у Т. топососсит, и позднее был назван Fr-A2.

Таким образом, гены Cbf, картированные в локусе Fr-A2, являются кандидатами, детерминирующими дифференциальную экспрессию cor 14b при определенных температурах, а также различия в морозоустойчивости. Интересно, что конститутивная экспрессия генов Cbf приводит к повышенной морозоустойчивости даже без низкотемпературного воздействия. При этом заметно меняется метаболизм, в частности, у арабидопсиса: содержание 325 метаболитов возрастает, причем содержание 256 из них возрастает в ответ на сверхэкспрессию Cbf3 даже без низкотемпературного воздействия.

Немаловажно также, что кластеры генов Cbf картированы в центре QTL-локусов морозоустойчивости и регуляции COR 14b генов у пшеницы и ячменя. Это является убедительным аргументом в пользу того, что именно они являются генами-кандидатами для локусов морозоустойчивости Fr-A2 и Fr-H2. Однако присутствие мультигенного семейства Cbf из 11 генов в общем кластере в одном и том же регионе делает невозможным вычленение того члена Cbf в локусе, который будет наилучшим кандидатом для объяснения фенотипической вариации морозоустойчивости.

Пороговые значения температурной индукции и скорость закаливания растений. Максимальная морозоустойчивость достигается только после нескольких недель закаливания. Термин «пороговая температура индукции» используется здесь, чтобы отметить температуры, достаточно низкие для индукции экспрессии соr-генов и начала процесса закаливания. Искомая температура для пшеницы, ячменя и ржи положительно коррелирует с морозоустойчивостью как при внутривидовом, так и межвидовом сравнении.

Кроме того, морозоустойчивые генотипы пшеницы отличаются большей скоростью акклимации в сравнении с более восприимчивыми при постоянных отрицательных температурах. Как показано на рисунке 5.5, выживаемость при -10 °C у более морозоустойчивого сорта Чейнни (Cheyenne) начинает повышаться при 3-дневной экспозиции при 2 °C, в то время как для достижения подобных результатов у неустойчивого сорта Чайниз Спринг (Chinese Spring) требуется 11 дней. Замещение хромосомы 5А у последнего сорта, в отличие от более устойчивого сорта, приводит к заметному ускорению процесса закаливания. Поскольку хромосомы 5А у обоих сортов содержат рецессивные аллели vm-A1, различия между ними не могут быть обусловлены различиями в процессах яровизации. Более правдоподобным представляется объяснение, согласно которому основную роль при этом играет полиморфизм в локусе Fr-A2. Действительно, количество транскриптов трех генов CBF, отмеченных выше, было в 4 раза выше у линий, несущих аллель Fr-A2. Различия в начальной скорости xолодовой акклимации у потомства от скрещивания морозоустойчивого сорта Норстар (Norstar) и неустойчивого сорта Монитоу (Manitou) были картированы в локусе Fr-A2, причем последний обусловливает 40% вариации морозоустойчивости. Эти результаты показывают, что более высокие уровни транскрипции генов CBF теоретически могут быть связаны с увеличением скорости xолодовой акклимации.

Взаимосвязь между морозоустойчивостью и яровизацией. Связь между морозоустойчивостью и признаком озимости можно объяснить на основе плейотропных эффектов локуса VRN-A1. Действительно, морозоустойчивость повышается в процессе xолодовой адаптации в фазе вегетативного развития, но снижается с переходом к фазе генеративного развития, когда уровень транскриптов VRN1 увеличивается. Линии гомозиготные по рецессивному аллелю гена Vrn1 (озимая форма) могут выдерживать температуру промораживания на 11 °C ниже, чем линии с доминантным аллелем vrn1 (яровая форма). Аналогично этому, яровые линии, растущие на коротком дне и с даунрегуляцией транскриптов vrn1, могут переносить температуры на 8,5 °C ниже, чем те же линии при выращивании на длинном дне.

Эта гипотеза основана на отрицательной корреляции между уровнем транскриптов vrn1 и транскриптов СОД-генов при холодовом воздействии. Кроме репрессии нескольких СОД-генов присутствие доминантных аллелей Vrn1, видимо, влияет на регуляцию некоторых генов CBF, что отмечено и на ячмене. Возможно наличие VRN1 в листьях служит сигналом для репрессии генов морозо- и холодоустойчивости. Эта гипотеза не исключает прямую связь между VRN1 и генами CBF или COR, поскольку после экспрессии VRN1 в листьях несколько генов экспрессируются или репрессируются. Для лучшего понимания молекулярных механизмов, вовлеченных в процессы ап-регуляции VRN1 и даун-регуляции COR генов, необходимо определить, возможно ли разорвать связь между этими двумя процессами.

Таким образом, даун-регуляция COR генов с помощью VRN1 может объяснить, как растения различают низкие температуры осенью от таковых весной. Это очень важно, поскольку низкие температуры предшествуют морозам осенью, но не весной. Осенью, когда VRN1 транскрибируется на достаточно низком (базовом) уровне в листьях, умеренные холодовые воздействия инициируют акклимационные процессы для последующей зимы. При тех же холодовых воздействиях весной, напротив, ап-регуляция VRN1 и его целевых генов не приводит к ап-регуляции СОR-генов. В соответствии с этой гипотезой, именно ген VRN1 несет ответственность за пониженную реакцию генов CBF и COR на холод. Для проверки этой гипотезы необходимы трансгенные или мутантные линии по VRN1. Кроме того, создание мутантов по различным генам CBF было бы полезным для оценки их индивидуальной роли в разных начальных скоростях xолодовой акклимации и пороговых значениях температур для индукции СОR-генов. Однако дополнительные функциональные связи между некоторыми генами CBF могут усложнить интерпретацию эффекта индивидуальных мутаций. Тандемная организация этих генов будет также ограничивать возможность использования скрещивания с целью объединения мутаций в разных генах CBF в двойные или тройные мутации. Однако эти ограничения можно преодолеть с помощью стратегии РНК-интерференции, а также репрессирования одновременно сразу нескольких генов CBF. Функциональная характеристика различных генов и аллелей CBF и создание улучшенных форм, сочетающих оптимальные аллели CBF, может стать эффективным инструментом для повышения морозо- и зимостойкости пшеницы и ячменя.

Методы селекции на морозоустойчивость. Роль научных исследований в разгадке феномена морозоустойчивости растений и выведении суперустойчивых генотипов пока весьма скромна. Основными причинами подобных результатов являются:

• исчерпание генетической вариабельности в пуле генов у большинства озимых культур;

• фенотипическое проявление признака определяется большим числом генов с незначительными эффектами и комплексными взаимодействиями, что усложняет селекцию;

• современные методы оценки морозоустойчивости характеризуются низкой чувствительностью и не дают возможности обнаружить небольшие фенотипические различия;

• слабая экспрессия генов морозоустойчивости не позволяет переносить пулы генов в другие виды, как, например, от ржи к пшенице.

Для реализации эффективной селекционной программы необходимо ответить на несколько вопросов:

1. Каковы климатические условия региона возделывания озимой культуры?

2. Каковы критические периоды онтогенеза в момент действия мороза?

3. Имеются ли источники генетической вариабельности морозоустойчивости у вида?

4. Какие методы наиболее предпочтительны для идентификации выдающихся особей в селекционной популяции? Отражают ли лабораторные методы оценки устойчивости полевую устойчивость?

5. Имеются ли в наличии необходимые ресурсы для внедрения результатов селекции?

В идеале методы селекции должны быть простыми, быстрыми, воспроизводимыми, недеструктивными (сохранять растение) и позволять определять потенциал морозоустойчивости отдельной особи. Целый ряд физиолого-биохимических и морфофизиологических показателей, определяемых в процессе акклимации к низким температурам, отвечает этим критериям. Однако использованию их в качестве тестов для предсказания искомой устойчивости мешают большие экспериментальные ошибки, которые не позволяют выявить небольшие различия, имеющие большое практическое значение для селекционеров.

Промораживание растений в лабораторных камерах часто используют в физиолого-генетических исследованиях для выявления минимальной температуры, переносимой генотипом. При этом скорость снижения температуры, как и ее повышение в репарационный период, а также условия в период репарации должны быть аналогичны условиям поля. Однако даже при соблюдении этих требований результаты необходимо интерпретировать со всей осторожностью. Плохое воспроизведение скорости холодовой акклимации в повторных опытах делает выбор критической (минимальной) температуры, переносимой растением при лабораторном промораживании, весьма сложным.

Таким образом, хотя контролируемые условия теоретически должны обеспечить более четкий контроль экспериментальных условий, сравнительные исследования показали, что полевые опыты обычно обеспечивают более воспроизводимые данные и меньшие ошибки в эксперименте. Поэтому в большинстве селекционных программ именно полевой скрининг используется для заключительной оценки морозостойкости озимых культур.
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: