Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Проявление окислительного стресса

10.11.2018

Перекисное окисление липидов. Разрушение мембранных липидов в результате их перекисного окисления является одной из основных причин нарушений функционирования клеток при охлаждении теплолюбивых растений.

К симптомам перекисного окисления липидов (ПОЛ) относятся: накопление малонового диальдегида (МДА), свободных жирных кислот, этанола и ацетальдегида, липидных флуоресцирующих пигментов, H2O2; разрушение хлорофилла и каротиноидов; снижение уровня полиненасыщенных жирных кислот; образование этана.

Интенсивность ПОЛ при холодовом выдерживании растений зависит от экспозиции, сопутствующих условий, в том числе температуры, видовых и сортовых особенностей. Так, способность проростков риса «тушить» активированный кислород постепенно уменьшалась с удлинением низкотемпературной экспозиции, при этом снижалась активность супероксиддисмутазы (СОД) и возрастало содержание МДА.

У проростков огурца, охлаждаемых при температуре 4 °C в течение 1—6 дней, усиления перекисного окисления тилакоидных липидов в темноте не происходило, но прогрессировало при возвращении после охлаждения к режиму освещения. Снижение активности СОД и содержания хлорофилла, увеличение МДА, изменения ультраструктуры хлоропластов в растениях риса также были выражены сильнее после холодового стресса на свету, чем в темноте. Вместе с тем у холодоустойчивого гороха охлаждение на свету не приводило к усилению ПОЛ.

В полевых опытах с просом наибольшее усиление ПОЛ в онтогенезе отмечено в фазе трех листьев, а наименьшее — в фазе выхода в трубку (рис. 4.1). Увеличение МДА у чувствительных сортов независимо от фазы развития было значительно выше, чем у устойчивых сортов.

Аналогичная тенденция отмечена и на сортах огурца. Интересно, что липидный комплекс в листьях растений проса проявлял самую большую устойчивость к охлаждению в фазу выхода в трубку. При этом более холодоустойчивые сорта характеризовались относительно быстрой нормализацией уровня МДА после окончания охлаждения. Видимо, интенсивность процессов ПОЛ в клетках при охлаждении прямо пропорциональна Холодовым нарушениям и обратно пропорциональна холодоустойчивости растений. Меньшему возрастанию содержания продуктов ПОЛ, в том числе МДА, будет соответствовать большая холодоустойчивость растений.

Образование свободных радикалов. Образование свободных радикалов при переохлаждении в тилакоидных мембранах, выделенных из листьев томата (Lycopersicon esculentum L.) и бобов (Viciafaba L.), после 12 ч охлаждения растений при температуре 4—7 °C было в 3 раза выше у первого, более теплолюбивого вида. Усиление освещенности при охлаждении увеличивало это отношение до 6, указывая на участие окислительного стресса в холодовом повреждении.

В динамике охлаждения теплолюбивых растений (но не картофеля) обнаружено существенное усиление генерации супероксидного анион-радикала, которое имело видовую специфику и у различных растений происходило в неодинаковой степени (рис. 4.2).

Это может быть связано с различиями в холодоустойчивости. Самое заметное увеличение супероксидного радикала было у зеленых растений кукурузы и огурца, что обусловлено слабой системой защиты от окислительного стресса, вызванного охлаждением. В то же время у картофеля (вида, относительно нечувствительного к пониженным температурам) отмечено снижение содержания радикала (при его достаточно высоком исходном уровне) по сравнению с неохлажденным контролем.

Увеличение накопления H2O2 во время холодовой акклимации проростков кукурузы происходило параллельно с увеличением активности каталазы и пероксидазы, при этом активность СОД не изменялась. Видимо, временное повышение H2O2 при акклимации дает сигнал к индукции антиоксидантных ферментов для нейтрализации H2O2. С другой стороны, охлаждение адаптированных проростков из-за низкого содержания антиоксидантных ферментов способствует накоплению в тканях H2O2 до уровня, повреждающего ткани.

Интересно, что обработка генетически трансформированных растений табака H2O2 приводила к временному всплеску Са2+-зависимой люминесценции (увеличению [Са2+]цит), что указывает на существенную роль ионов Ca2+ в реакции растений на окислительный и холодовой стресс.

Антиоксиданты. Уровень трех эндогенных антиоксидантов (АО) — аскорбата, восстановленного глутатиона и а-токоферола — понижался в отделенных листьях огурца и кукурузы при низкотемпературном фотоокислении. У огурца единственным АО, осуществляющим длительную защиту фотосинтетических пигментов, был а-токоферол, который поражался первым. Холодоустойчивость генотипов кукурузы коррелировала с увеличением содержания а-токоферола и аскорбата в листьях.

В опытах с растениями огурца и гороха показано, что а-токоферол представляет собой первый рубеж защиты фотосинтетических пигментов. Содержание а-токоферола в листьях чувствительного к холоду огурца резко упало сразу после понижения температуры, а у устойчивого гороха в течение достаточно длительного периода практически не изменилось. У кукурузы наблюдалась фактически та же тенденция, что и у огурца, однако при достаточно длительной холодовой экспозиции не установлено существенных различий у линий, различающихся по холодоустойчивости. Видимо, а-токоферол представляет собой не самый главный фактор холодоустойчивости, по крайней мере у кукурузы.

Восстановленный глутатион и аскорбат заслуживают особого внимания, поскольку оба участвуют в обезвреживании (тушении) H2O2 и других токсических компонентов. Содержание восстановленного глутатиона в семядольных листьях огурца уменьшалось в 2 раза с падением температуры до 0 °C. Это снижение усиливалось после предварительной обработки метилвиологеном и МДА. Содержание глутатиона в охлажденных растениях риса и кукурузы было выше у более устойчивых к холоду сортов. У охлажденных в темноте проростков огурца слегка понижались уровни а-токоферола и b-каротина, а восстановленного глутатиона и аскорбиновой кислоты почти не менялись. После охлаждения растений томатов содержание а-токоферола и отношение восстановленных/окисленных форм аскорбата и глутатиона понижались, причем сильнее у теплолюбивого Lycopersicon esculentum L. У холодоустойчивого Lycopersicon hirsutum L. увеличивалось содержание общего аскорбата, глутатиона и каротиноидов.

Экзогенная обработка листьев кукурузы аскорбатом не снижала индуцированную охлаждением при высокой освещенности деградацию пигментов и а-токоферола и повышала потребность в восстановленном глутатионе.

Содержание аскорбата, глутатиона и каротиноидов возрастает в условиях, содействующих проявлению окислительного стресса. Что касается концентрации глутатиона, то у проростков кукурузу она в фазе первого листа возрастала как при короткой, так и при относительно длительной холодовой экспозиции, снижаясь впоследствии. Большой пул восстановленного глутатиона, видимо, позволяет восстановить достаточно аскорбата в отсутствие высокоактивной глутатионредуктазы или высоких концентраций НАДФН, при наличии которых запасание большого количества быстродоступного восстановленного аскорбата может быть и не обязательным. Однако только повышенные уровни глутатиона, вероятно, недостаточны для уменьшения индуцированного холодом фотоокислительного стресса.

Уменьшение уровня каротиноидов отмечено при краткосрочном холодовом воздействии как у чувствительного к холоду томата, так и холодоустойчивой пшеницы. Концентрация b-каротина у кукурузы снижалась также при более длительной экспозиции. Хотя содержание b-каротина у линий кукурузы разной степени холодоустойчивости повышалось или понижалось при короткой и продолжительной экспозиции в зависимости от фазы развития, у наиболее чувствительных линий оно неизменно было минимальным. Поскольку b-каротин принимает непосредственно участие в «тушении» O2 и ингибировании его образования, низкое содержание этого липофильного антиоксиданта представляет собой непременное условие чувствительности к холоду.

Накопление антоциана в вегетативных тканях является хорошим индикатором действия холода. Это согласуется с недавними данными об антоциане как о биологически активном антиоксиданте, а не просто вторичном пигменте. Видимо, он вносит определенный вклад в общую систему защиты при окислительном стрессе, но каков этот вклад в «тушение» АФК и/или других свободных радикалов предстоит выяснить.

Антиоксидантные ферменты. Особое значение в противодействии окислительному стрессу и перекисному окислению при действии пониженных температур имеют антиоксидантные ферменты — супероксиддисмутаза (СОД), пероксидаза, каталаза и др. СОД многократно снижает концентрацию O2, а пероксидаза и каталаза устраняют избыток перекисей, образованных СОД из O2.

Супероксиддисмутаза хлоропластов после охлаждения растений риса и кукурузы заметно снижалась с одновременным возрастанием концентрации МДА, а у огурца и шпината она изменялась мало. После охлаждения растений кукурузы активность цитозольной и митохондриальной СОД понижалась у чувствительной линии и возрастала у устойчивой. Активность хлоропластной СОД была пониженной у всех линий. Видимо, чувствительность теплолюбивых растений к низкотемпературному фотоингибированию не может быть объяснена различиями только в активности хлоропластной СОД. Вместе с тем трансгенные растения табака со сверхпроизводством хлоропластной Cu/Zn-СОД (из гороха) при охлаждении поддерживали более высокую интенсивность фотосинтеза, чем исходные растения, и проявляли меньшее повреждение клеток гербицидом метилвиологеном, который генерирует супероксид. Более того, изучение экспрессии генов, кодирующих различные формы СОД, указало на увеличение соответствующих мРНК СОД при охлаждении. Следовательно, Cu/Zn-СОД, Mn-СОД и Fe-СОД можно рассматривать в качестве молекулярных индикаторов окислительного стресса, которому подвергаются цитоплазма, митохондрии или хлоропласты.

Выдерживание теплолюбивых растений при 2 °C приводило к снижению активности цитозольной СОД в различной степени у разных растений (табл. 4.1).

Так, после часового охлаждения зарегистрировано снижение активности СОД у этиолированных проростков кукурузы в 2,3 раза по сравнению с неохлажденным контролем, у зеленых растений кукурузы и проса — почти в 3 раза. Самое значительное снижение (более чем в 6 раз) активности было в листьях огурца. После 2-часового выдерживания при пониженной температуре активность СОД у всех теплолюбивых растений несколько возрастала по сравнению с первым часом охлаждения, но все еще была существенно ниже контроля.

Подавление активности СОД происходило наиболее быстро и сильно у огурца, менее значительно — у проса и кукурузы. Колебания активности СОД у побегов картофеля в динамике охлаждения были невелики и не имели определенной направленности. Таким образом, изменения активности фермента в основном согласуются с холодовой чувствительностью видов. В то же время прямая корреляция между интенсивностью ПОЛ как критерия холодового повреждения и активностью СОД отсутствует (значения коэффициентов корреляции не превышали 0,24). Это можно объяснить различиями в динамике активности фермента (инактивация в начале холодовой экспозиции с последующим повышением) и развития холодового повреждения (повышение МДА в начальный период и в конце охлаждения).

Аскорбатпероксидаза (АПО), локализованная в хлоропластах (строме и тилакоидах), митохондриях, микротельцах и цитозоле, является основным ферментом, утилизирующим перекись водорода у растений. При охлаждении растений кукурузы и огурца активность АПО в листьях была резко снижена, что отрицательно коррелировало с усилением выхода электролитов и содержанием МДА и лимитировало холодоустойчивость на ранних фазах развития. Предварительная обработка метилвиологеном или МДА усиливала инактивацию, а бензоатом натрия и а-токоферолом ослабляла ее. Снижение активности и кинетических характеристик АПО было выражено сильнее у холодочувствительных видов и гибридов (величина активности АПО иногда используется в качестве индикатора холодового стресса при скрининге кукурузы на холодоустойчивость). Вместе с тем в ряде исследований изменений активности АПО у растений при холодовой экспозиции не выявлено.

Особое значение имеет повышенная активность фермента в репарации вызванных охлаждением повреждений, что проявляется в последействии пониженных температур (спустя сутки после охлаждения), когда у всех теплолюбивых культур активность АПО значительно превышала уровень в контроле. Это указывает на существенный вклад АПО в репарацию холодового повреждения в тканях теплолюбивых растений после длительного охлаждения.

Катал аза — первичный антиоксидантный фермент, который может быстро удалить H2O2. При охлаждении ряда видов растений (кукурузы, риса, огурца, арабидопсиса) обнаружено резкое снижение активности каталазы, причем более значительное у теплолюбивых генотипов, что предполагает возможность ее использования в скрининге на холодоустойчивость. Так, степень холодоустойчивости у томата прямо коррелировала с активностью каталазы. После окончания охлаждения растений риса и кукурузы отмечено восстановление активности фермента у относительно холодоустойчивых линий и снижение у теплолюбивых. Как холодовая акклимация растений, так и их кратковременный отогрев во время охлаждения приводили к существенному возрастанию активности каталазы и снижению холодового повреждения. Трансгенные формы томата с активностью каталазы, сниженной в 2-8 раз, проявляли и пониженную холодоустойчивость. Все это указывает на важную роль каталазы в системе защиты теплолюбивых растений от пониженных температур. С другой стороны, дефицитные по каталазе растения табака не проявляли повышенной чувствительности к охлаждению. По-видимому, сниженную активность гашения H2O2 каталазой при охлаждении могут компенсировать альтернативные механизмы, например, повышенная активность аскорбат- и глутатионпероксидазы.

Действительно, активность каталазы у многих культур при низких положительных температурах как снижалась, так и оставалась равной значениям в контроле или даже увеличилась. При этом концентрация H2O2 в охлажденных тканях кукурузы возрастала. Ап-регуляция каталазы важна для поддержания низкого уровня H2O2 у адаптированных к холоду проростков в темноте. Отмеченная выше разная реакция активности каталазы на понижение температуры обусловлена видовой спецификой, фазой развития, продолжительностью и силой действия стрессора, а также тем, действует ли фактор на свету или в темноте. Фотоингибирование фермента при действии холода на свету опосредовано поглощением света гемом каталазы и хлоропластными пигментами.

Аскорбатредуктаза реагирует на холод по-разному: ее активность может увеличиваться как при краткосрочном (пшеница), так и длительном (шпинат) действии холода, или остается без изменения (томаты). У линий кукурузы с разной холодостойкостью тоже отмечено как увеличение, так и уменьшение активности данного фермента в зависимости от фазы развития или генетически детерминированной холодоустойчивости. Относительно короткая холодовая экспозиция проростков кукурузы разных линий приводила к снижению активности СОД, а также к снижению или увеличению аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы. Более продолжительное действие стрессора повышало активность СОД и не всегда глутатионредуктазы.

Дегидроаскорбатредуктаза изменялась мало и не зависела от экспозиции. Хотя образование дегидроаскорбата — процесс не энзиматический, его предшественники находятся под контролем антиоксидантной системы, в частности аскорбатпероксидазы.

Таким образом, AO-ферменты играют существенную роль в реакции теплолюбивых растений на охлаждение. При этом одно из основных различий между чувствительными и холодоустойчивыми видами лежит в способности последних уменьшать повреждающее действие холода и индуцированное охлаждением образование АФК путем повышения активности ферментов АОС. Эти изменения носят адаптивный характер и направлены на снятие окислительного стресса и тем самым холодового повреждения. Виды и сорта, проявляющие меньшую степень инактивации АО-ферментов при охлаждении и быстрое восстановление их активности, будут и более холодоустойчивыми относительно видов или сортов, имеющих выраженные нарушения ферментативной деятельности.

АОС, как правило, индуцируется при повышении уровня АФК, в ответ даже на небольшое действие стрессора или в период низкотемпературного закаливания до начала действия более сильного стрессора. Образование АФК, превышающее возможности их тушения, как, например, при сильном стрессе без предварительной Холодовой адаптации, может привести к гибели растения. Вместе с тем увеличение активности СОД, аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы может и не быть результатом увеличения только экспрессии генов или мРНК, или содержания белков. Возможны резкие изменения во внутриклеточном распределении и дифференциальной чувствительности к фотоокислению разных изозимных форм ферментов с различным сродством к субстратам. Вариабельная антиоксидантная реакция вида на различную силу и/или длительность холодового воздействия несомненно вносит вклад не только в генетику устойчивости данного вида, но и в способность экспрессировать гены устойчивости к холоду.

Возникает вопрос, могут ли растения с более высоким антиоксидантным потенциалом переносить более сильное холодовое воздействие, чем растения с относительно низким потенциалом? Привлечение для исследования разных видов, отличающихся по холодоустойчивости, для ответа на этот вопрос может быть малоперспективным. Это обусловлено тем, что генетические и метаболические механизмы, лежащие в основе одинаковой холодоустойчивости у двух видов, могут быть совершенно разными. Поэтому предпочтительнее использовать в эксперименте сорта (линии) одной культуры с различной холодоустойчивостью. Поскольку они представляют один генотип, снижается сложность анализа генетических различий и вариабельности. Поэтому весьма интересно профилирование антиоксидантов у инбредных линий и/или гибридов кукурузы с разной холодоустойчивостью. Однако даже с учетом предыдущих и этих данных можно сказать, что единственного фактора, детерминирующего холодоустойчивость, нет. Вместе с тем достаточно много данных, указывающих на то, что наиболее чувствительные к холоду виды растений отличаются наименьшими активностями каталазы и аскорбатпероксидазы и содержанием глутатиона и b-каротина. Оптимальная конфигурация различных антиоксидантов для противодействия окислительному стрессу, видимо, зависит от вида, фазы развития, предыдущих условий и сопутствующих факторов и может изменяться в зависимости от напряженности и длительности стрессового воздействия.
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: