Электромонтаж Ремонт и отделка Укладка напольных покрытий, теплые полы Тепловодоснабжение

Проблема клеточной сигнализации

10.11.2018

На растения может действовать множество экстремальных факторов (стрессоров), вызывающих снижение урожайности на 50% и более. Воздействие на растение абиотических (засуха, засоление, низкие температуры, тяжелые металлы и др.) и биотических (патогены) факторов приводит к целому ряду неспецифических ответных реакций, что и позволило называть их адаптационным синдромом, или стрессом. Указанные выше реакции являются результатом «включения» стрессорами неспецифических сигнальных систем в клетке.

Предметом исследования клеточной сигнализации (англ. — cell signaling), давшей начало новой области биохимии, являются молекулярные механизмы регуляции клеточного метаболизма внешними (первичными) сигналами, несущими в клетку информацию, что принципиально отличает их от поступающих в клетку химических соединений, служащих для нее источником материи и энергии. В отечественной литературе в соответствующих случаях говорят о молекулярных механизмах передачи (трансдукции) внешних сигналов в клетку. Однако понятие «клеточная сигнализация» подразумевает не только передачу сигналов как таковую, но и весь комплекс событий, с ней сопряженных, в том числе усиление (амплификацию), ослабление (аттенуацию) и подавление (выключение) сигналов.

Звенья сигнальных систем. Сигналы, поступающие из окружающей среды, улавливаются клеткой с помощью специальных «антенн» — рецепторных белковых молекул, пронизывающих клеточную мембрану и выходящих на наружную и внутреннюю ее стороны. Нековалентное взаимодействие внешнего участка рецептора с той или иной сигнальной молекулой, поступающей из окружающей клетку среды, приводит к изменению конформации рецепторного белка, которое передается на внутренний цитоплазматический участок. В большинстве сигнальных систем с ним контактируют посреднические G-белки — еще одно унифицированное по структуре и функциям звено сигнальных систем. G-белки выполняют функции преобразователя сигналов, передавая сигнальный конформационный импульс на стартовый фермент, специфичный для той или иной сигнальной системы. Еще одним звеном сигнальных систем являются протеинкиназы (ферменты, переносящие концевой остаток ортофосфорной кислоты с АТФ на белки), активируемые продуктами стартовых сигнальных реакций или их производными. Фосфорилированные с помощью протеинкиназ белки являются следующими звеньями сигнальных цепей. Еще одно унифицированное звено сигнальных систем клеток — белковые факторы регуляции транскрипции представляют собой один из субстратов протеинкиназных реакций. Структура этих белков также в значительной степени унифицирована, а модификации структуры определяют принадлежность факторов регуляции транскрипции к той или иной сигнальной системе. Фосфорилирование факторов регуляции транскрипции обусловливает изменение конформации этих белков, их активацию и последующее взаимодействие с промоторным участком определенного гена, что приводит к изменению интенсивности его экспрессии (индукции или репрессии), а в крайних случаях — к «включению» некоторых молчавших или «выключению» активных генов. Репрограммирование экспрессии совокупности генов генома вызывает изменение соотношения белков в клетке, являющееся основой ее функционального ответа. В отдельных случаях химический сигнал из внешней среды может взаимодействовать с рецептором, расположенным внутри клетки — в цитозоле или даже ядре (рис. 1.1). Однако поскольку информационный путь имеет меньшее число интермедиатов, у него и меньше возможностей для регуляции со стороны клетки.

Внешняя среда, рецепторы, мессенджеры. Разнообразные молекулы, инициирующие транс-мембранную передачу сигналов, активируют рецепторы, действуя на них обычно при очень низких концентрациях (порядка 10в-8 M и ниже). Активированный рецептор тем или иным способом передает сигнал к внутриклеточным мишеням. Если мишень, или эффекторный белок, представлена ферментом, то сигнал модулирует (увеличивает или уменьшает) его каталитическую активность. Если эффекторным белком служит ионный канал, то модулируется проводимость этого канала. В обоих случаях результатом будет изменение активности какой-то метаболической стадии (стадий) либо цитоплазматической концентрации того или иного иона и как следствие возникновение клеточного ответа.

«Молекулярные машины», обеспечивающие передачу сигнала от рецепторов к внутриклеточным мишеням, состоят, как правило, из нескольких белковых компонентов, совокупность которых обычно именуют каскадом передачи сигнала или просто каскадом. Помимо белковых посредников в передачу сигнала внутри клетки во многих случаях вовлекаются и относительно небольшие молекулы, служащие вторичными сигналами, — вторичные посредники, или мессенджеры (от англ. messenger — посыльный). Для обозначения сигнальных молекул мы будем использовать термин «мессенджер». Вовлеченные в передачу сигнала в цитоплазме разнообразные белки и малые молекулы (собственно вторичные сигналы) функционально являются посредниками между рецептором, на который подействовал внешний стимул, и клеточным ответом. Однако между ними есть и принципиальное различие. Белки образуют своеобразную «молекулярную машину», которая, с одной стороны, «чувствует» внешний сигнал, а с другой — обладает ферментативной или иной активностью, модулируемой этим сигналом. Малые молекулы действительно служат посыльными (мессенджерами) между различными белками, полиферментными комплексами или даже клеточными структурами.

Наиболее универсальными вторичными мессенджерами являются ионы кальция (Ca2+), цАМФ, цГМФ, ДАГ, ИТФ. Вторичные мессенджеры значительно усиливают первичный сигнал. В результате одна-единственная молекула гормона может привести к активации фермента, продуцирующего многие сотни молекул вторичных мессенджеров.

В норме концентрация вторичных мессенджеров в клетке ничтожно мала. В ответ на связывание гормона или другое раздражение активированный рецептор передает сигнал на ферментные системы образования одного или нескольких вторичных мессенджеров. Концентрация мессенджеров в цитоплазме резко возрастает, после чего возвращается к исходному низкому уровню. Кратковременный «всплеск» уровня вторичного мессенджера в клетке оказывается достаточным для активации или инактивации ферментов и регуляторных белков, инициирующих ответ организма на сигнал.

Ионы кальция. В растительных клетках Ca2+ содержится в клеточных стенках в форме пектатов, карбонатов, сульфатов, но большинство — в вакуоли в форме оксалата благодаря работе Са2+/Н+-антипорта тонопласта. Его концентрация в цитозоле в нормальных условиях крайне низка (около 1*10в-7 М), но в митохондриях и ЭПР она заметно выше (до 1*10в-3 М). Такой огромный градиент поддерживается благодаря работе расположенной на плазмалемме Ca2+-АТФазе, которая выбрасывает Ca2+ из цитозоля в свободное пространство клеточной стенки. Вторая Ca2+-АТФаза, также снижающая концентрацию Ca в цитозоле, находится на мембранах ЭПР и транспортирует кальций в цистерны из цитозоля.

В ответ на действие различных факторов открываются кальциевые каналы и концентрация Ca2+ в цитозоле возрастает в течение секунд или минут. Однако подобная динамика носит обратимый характер.

Ион кальция может связываться с содержащимся в митохондриях, хлоропластах, клеточных стенках регуляторным белком кальмодулином, имеющим четыре участка с высоким сродством к Ca2+. Связывание с Ca2+ изменяет конформацию молекулы кальмодулина, что придает этому комплексу способность активировать некоторые ферменты: Са2+-АТФазы, НАД-киназы, НАД-оксидоредуктазы, протеинкиназы, липазы.

Протеинкиназы — ферменты, фосфорилирующие белки (структурные, транспортные и регуляторные) по строго определенным группам (серина, треонина и тирозина), что приводит к изменению структуры белковой молекулы и ее функциональной активности. Активированная протеинкиназа переносит фосфатную группу с АТФ на белки, которые активируют другие ферменты. Биологический смысл этой цепи реакций состоит в усилении первичного сигнала, вследствие чего включается синтез стрессорных белков, защитных соединений (сахарозы, пролина, олигосахаров), меняется липидный и белковый состав мембран.

Протеинкиназы активируются кальцием, фосфолипидами (фосфатидилсерином) и ДАГ. В растениях функционирует Са2+-зависимая протеинкиназа (CDPK), участвующая в трансдукции сигнала. Причем одна из ее субъединиц — кальмодулин способен связывать ионы кальция. Большинство ответных реакций, вызываемых Ca2+, обусловлены активацией CDPK, которая затем переносит фосфатную группу с АТФ на белки.

В клетке существует серия протеинкиназ, которые последовательно фосфорилируют друг друга, в результате происходит «каскад» реакций, названный МАРК-каскадом (от англ. Mitogen Activated Protein Kinese). Первый фермент в этой последовательности, который называется MAPKKK (МАР-киназа-киназа киназы), «запускает» весь каскад. MAPKKK передает фосфорный остаток другой киназе — MAPKK (MAP-киназа киназы), которая, в свою очередь, передает сигнал MАР-киназе (МАРК). Она направляется к ядру, где активирует другие протеинкиназы и различные транскрипционные факторы, которые связываются с цис-действующими регуляторными элементами и вызывают дифференциальную экспрессию генома. МАРК-каскад является важным способом передачи (трансдукции) внутриклеточного сигнала у растений.

Циклические мононуклеотиды. Помимо ионов кальция наиболее универсальными вторичными мессенджерами являются циклические мононуклеотиды. У животных цАМФ и цГМФ играют важную роль в регуляции клеточных процессов. Циклический АМФ образуется из АТФ в результате отделения двух остатков фосфорной кислоты и последующего замыкания оставшейся фосфатной группировки в кольцо. Эта реакция катализируется аденилатциклазой, которая расположена на внутренней поверхности мембран и работает в присутствии фосфолипидов и ионов магния. В растениях концентрация цАМФ крайне низка. В последние годы накапливается все больше данных в пользу того, что цАМФ в растительных клетках выполняет столь же важную сигнальную роль, как в клетках животных и прокариот. Циклический АМФ действует как аллостерический эффектор по отношению к протеинкиназам, которые фосфорилируют ядерные, цитоплазматические и мембранно-связанные белки.

В последнее время появляются доказательства того, что цГМФ, который в животных клетках регулирует ионные каналы и протеинкиназы, в растениях тоже функционирует в качестве вторичного мессенджера.

Основные типы мембранных рецепторов. Существуют три основных типа рецепторов, интегрированные во внешнюю клеточную мембрану: 1) рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR); 2) рецепторы — ионные каналы; 3) рецепторы, ассоциированные с ферментативной активностью.

GPCR передают сигнал от первичных мессенджеров к внутриклеточным мишеням с помощью каскада: GPCR => G-белок => эф-фекторный белок. Первичными сигналами для этих рецепторов служат самые разнообразные молекулы. В животных клетках это низкомолекулярные гормоны и нейропередатчики, или нейротрансмиттеры (например, адреналин, ацетилхолин, норадреналин и др.). Некоторые из них обнаружены и в растениях. Один и тот же первичный сигнал может инициировать передачу сигнала через несколько (иногда более 10) разных GPCR, так что если число внешних сигналов для GPCR составляет несколько десятков, то самих таких рецепторов известно более 200. При всем их разнообразии GPCR представляют собой мономерные интегральные мембранные белки, полипептидная цепь которых семь раз пересекает клеточную мембрану. Во всех случаях участок рецептора, ответственный за взаимодействие с первичным сигналом, локализован с внешней стороны мембраны, а участок, контактирующий с G-белком, — на ее цитоплазматической стороне.

На следующем за рецептором этапе каскада передачи сигнала с участием GPCR действует G-белок. Найдено около 20 его разновидностей.

Важнейшая характеристика G-белков — присутствие на их а-субъединице центра связывания гуаниловых нуклеотидов: ГДФ и ГТФ. Если с G-белком связан ГТФ, то это соответствует его активированному состоянию (G-ГТФ), иначе, G-белок находится в положении «включено». Присутствие в нуклеотидсвязывающем центре ГДФ (G-ГДФ) соответствует состоянию «выключено». Центральное событие при передаче сигнала от рецептора, на который подействовал первичный сигнал, к G-белку состоит в том, что активированный рецептор катализирует обмен ГДФ, связанного с G-белком, на присутствующий в среде ГТФ. Это событие, обозначаемое как ГДФ/ГТФ-обмен на G-белке, сопровождается диссоциацией тримерной молекулы G-белка на две функциональные субъединицы: а-субъединицу, содержащую ГТФ, и bу-комплекс. Далее одна из этих функциональных субъединиц (какая именно — зависит от типа сигнальной системы) взаимодействует с эффекторным белком, представленным ферментом или катионным каналом. Как следствие, их каталитическая активность или ионная проводимость меняется соответствующим образом, что, в свою очередь, приводит к изменению цитоплазматической концентрации вторичного мессенджера (или катиона) и в конечном счете инициирует тот или иной клеточный ответ.

Весьма важно, что при передаче сигнала в каскаде (рецептор => G-белок => эффекторный белок) исходный внешний сигнал может многократно усиливаться, или амплифицироваться. Это происходит благодаря тому, что одна молекула рецептора за время пребывания в активированном состоянии (R*) успевает перевести в активированную форму (G*) несколько молекул G-белка. В конечном счете коэффициент амплификации сигнала при его прохождении через каскад может достигать весьма высоких значений: в зрительных клетках это величина порядка 10в 5-10в6.

Очевидно, что прекращение действия внешнего стимула должно сопровождаться «выключением» всех компонентов сигнальной системы. На уровне рецепторов это достигается, во-первых, в результате диссоциации первичного сигнала из комплекса с GPCR, во-вторых, путем фосфорилирования рецепторов под действием специальных протеинкиназ и последующего связывания с модифицированным рецептором специального белка.

Поскольку состояние активации эффекторного белка («включен-выключен») напрямую зависит от состояния G-белка, этот переход означает также выключение эффекторного белка, а следовательно, прекращение синтеза (гидролиза) вторичного мессенджера или закрывание ионного канала. И, наконец, чтобы переход клетки к исходному (до действия внешнего стимула) состоянию завершился, специальные механизмы восстанавливают исходный уровень вторичного мессенджера или катиона в ее цитоплазме.

Рецепторы — ионные каналы — это интегральные мембранные белки, состоящие из нескольких субъединиц, полипептидная цепь которых несколько раз пересекает наружную клеточную мембрану. Они действуют одновременно и как ионные каналы, и как рецепторы, способные специфически связывать со своей внешней стороны первичные сигналы, изменяющие их ионную (катионную или анионную — в зависимости от типа рецептора) проводимость.

Рецепторы, ассоциированные с ферментативной активностью, по своей четвертичной (субъединичной) структуре весьма разнообразны. За некоторыми исключениями они представляют собой либо мономеры, которые при связывании с ними первичного мессенджера димеризуются, либо олигомеры, образованные несколькими субъединицами различных типов. Практически у всех этих рецепторов полипептидные цепи мономерных субъединиц однократно пересекают клеточную мембрану. Общим для них является также то, что участок для связывания первичного сигнала локализован на рецепторе со стороны, обращенной во внеклеточное пространство.

В настоящее время интенсивно исследуются МАР-киназная, аденилатциклазная, фосфатидатная, кальциевая, липоксигеназная, НАДФН-оксидазная, NO-синтазная и протонная сигнальные системы, их роль в онтогенетическом развитии растений и в формировании ответа на изменяющиеся условия существования, особенно на действие различных абиотических и биотических стрессоров. Рассмотрим в качестве примера MAP-киназную и фосфатидилинозитольную сигнальную систему.

MAP-киназная сигнальная система. Митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК) и МАР-киназный сигнальный каскад (сигнал => рецептор => G-белки => MAPKKK => MAPKK => МАРК => ФРТ => геном), достаточно полно изученные в животных объектах, функционируют и в растительных клетках (рис. 1.2). МАР-киназный каскад «включается» при митозе (чем и объясняется название этих протеинкиназ), при обезвоживании, гипоосмотическом стрессе, низкой температуре, раздражении растений, повреждении тканей, окислительном стрессе, действии патогенов, элиситоров, стрессовых фитогормонов (жасмоната, салицилата, системина, этилена).

Зависимость функционирования MAP-киназного каскада от различных воздействий нашла отражение в названиях некоторых MAP-киназ, например WIPK (Wound-Induced Protein Kinases), индуцируемые механическим повреждением протеинкиназы или SIPK (Salicylate-in-duced Protein Kinases) — салицилатиндуцируемые протеинкиназы. Оказалось, что активация WIPK осуществляется не только при повреждении тканей растений, но и при их инфицировании вирусом табачной мозаики, а активация SIPK — при действии олигосахаридных элиситоров и белковых элиситинов.

Обнаружены индукция образования транскриптов протеинкиназ МАРК-сигнальной системы и связанная с этим их активация под влиянием различных стрессоров. Чаще всего интермедиаты MAP-киназной сигнальной системы активируются или инактивируются за счет посттрансляционной модификации, подвергаясь главным образом фосфорилированию или дефосфорилированию с помощью соответствующих протеинкиназ и протеинфосфатаз.

MAP-киназная сигнальная система активируется многими внеклеточными сигналами, что объясняется большим разнообразием представителей стартового фермента в цепи киназ. Все МАРКК-киназы (MAPKKK) подразделяются на четыре группы в зависимости от особенностей первичной структуры, о которой стало возможным судить после клонирования соответствующих генов. Различия касаются в первую очередь структуры регуляторного домена, но они обнаружены также в других доменах, таких, например, как zinc zipper (в пер. с англ. — цинковая застежка-молния), лейциновые «застежки», места связывания G-белков, несколько мест фосфорилирования тирозиновых, сериновых и треониновых остатков.

Как уже отмечалось, в соответствии с разнообразием структуры МАРКК-киназ представители этого семейства могут активироваться различными источниками сигналов. Это могут быть другие протеинкиназы (ПКС и МАРКККК), различные G-белки семейств Ras и Rho. MAPKK имеет более ограниченные возможности регуляции в связи с меньшей вариабельностью структурных элементов ее ферментов. В еще большей степени это касается МАРК. MAPKKK катализирует фосфорилирование остатков серина и треонина в МАРКК, а последняя — остатков треонина и тирозина в МАРК. По всей вероятности, МАРКК активирует (путем фосфорилирования) лишь МАРК. Можно сделать вывод, что в случае с каскадом MAPKKK => МАРКК => МАРК мы имеем дело с сигнальной «воронкой», с конвергенцией сигнальных путей, инициируемых в пределах МАРК-системы различными элиситорами. В этом случае последнее звено этой системы MAP-киназа может активировать лишь один тип факторов регуляции транскрипции, вызывая экспрессию более узкого круга генов, чем можно было бы ожидать, если иметь в виду большое разнообразие МАРККК. MAP-киназа может также катализировать фосфорилирование цитоскелетных белков и фосфолипаз, активируя их.

К 2000 г. были уже клонированы гены 17 представителей МАРККК, МАРКК и 28 представителей MAP-киназ из различных видов растений. Сегодня их число заметно больше.

Поскольку активация сигнальных систем носит преходящий характер, должны быть эффективные механизмы их самоингибирования. Инактивация MAP-киназной сигнальной системы осуществляется, в первую очередь, за счет дефосфорилирования МАРК с помощью протеинфосфатаз. Все имеющие отношение к MAP-сигнальному каскаду протеинфосфатазы подразделяются на три группы: ферменты двойной специфичности, осуществляющие дефосфорилирование остатков тирозина и треонина в МАР-киназах, тирозиновые протеинфосфатазы и серин-треониновые протеинфосфатазы.

Фосфатидилинозитольная система. Фосфатидилинозитольная система является одним из механизмов передачи стрессорного сигнала в клетке животных. Под действием внешнего фактора изменяется структура молекулы белка-рецептора, находящегося в плазмалемме. Изменение конформации рецептора передается регуляторному G-белку, находящемуся рядом, в мембране, а от него — ферменту фосфолипазе С, которая функционирует на внутренней стороне плазмалеммы. Фосфолипаза становится активной и катализирует реакции, в результате которых образуются два вещества-мессенджера: ДАГ и ИТФ. Растворимый в воде ИТФ диффундирует в цитозоле до тех пор, пока не встретится со специальными сайтами (кальциевые каналы) на мембране ЭПР или тонопласта, которые при взаимодействии с ИТФ открываются. Поскольку концентрация кальция в цитозоле крайне низка, то он быстро выделяется из ЭПР в цитозоль по градиенту концентрации. Одновременно ДАГ при участии Ca2+ активирует находящуюся в плазмалемме протеинкиназу С, которая фосфорилирует белки кальциевых каналов плазмалеммы, таким образом активируя их работу. В результате этих процессов концентрация Ca2+ в цитозоле увеличивается и в свою очередь активирует протеинкиназы и другие ферменты. Итак, ИТФ и ДАГ участвуют в регуляции работы Са2+-каналов и направления Са2+-потоков, что полностью доказано для животных клеток.

Перспективы исследований. В перспективе будут актуальны исследования и разработки, связанные с сигнальными системами и сетями: поиск новых сигнальных систем и минорных участников уже известных сигнальных систем; расшифровка особенностей функционирования сигнальной сети как единого целого; «привязка» отдельных сигнальных систем к тому или иному виду сигналов и рецепторов; дальнейшее выяснение структуры промоторных участков и молекулярного механизма их взаимодействия со «своими» факторами регуляции транскрипции у различных генов; расшифровка механизмов, обусловливающих временной характер включения тех или иных сигнальных систем; характеристика видовой, органной и тканевой специфичности функционирования сигнальных систем; создание трансгенных форм растений с видоизмененными сигнальными системами или сверхустойчивых к биогенным и абиогенным стрессорам конструирование трансгенных форм растений с генами защитных белков, в том числе прямого антипатогенного действия; использование приемов генетической инженерии растений для получения стресс-толерантных генотипов агрономически значимых культур.
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: